一种SUMO蛋白酶基因、重组表达载体、工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程。具体涉及一种sumo蛋白酶基因、含有所述sumo蛋白酶基因的重组表达载体、表达所述sumo蛋白酶的工程菌及其应用。

背景技术：

1、小分子泛素相关修饰蛋白(sumo)是一类泛素相关蛋白质，通过结合赖氨酸侧链来调节靶蛋白的功能。近年来，sumo标签已经成为一种有效的生物技术工具，通过sumo与靶蛋白融合可以促进蛋白质折叠，增强蛋白质的可溶性表达，保护蛋白质免受蛋白酶水解，提高蛋白质的稳定性，已经成功表达多种异源蛋白。传统融合标签蛋白在后续切割过程中只被相应的蛋白酶识别一级氨基酸序列，这种识别方式会由于空间阻遏导致切割蛋白酶酶切效率不高。但sumo标签蛋白可被sumo蛋白酶ulp1特异性识别三级结构并精准切割，切割后无氨基酸残留，所以sumo标签是目前原核蛋白融合表达的最为理想的融合标签之一而被广泛使用。

2、sumo蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶超家族的成员之一，在真核生物中主要行使两种生理功能：(1)切除sumo前体c末端的-gg-aty序列，使之变成成熟态的-gg；(2)去sumo化，将sumo从作用的靶蛋白切割下来。到目前为止，酵母中发现两种sumo蛋白酶：ulp1和ulp2；这两种ulp共有一段约200氨基酸的催化结构域称为ulp，即ulp1(403～621)，ulp显示了完整的蛋白酶活性，在人类中共发现7种sumo特异性蛋白酶。

3、ulp因sumo标签在生物工程中的广泛应用而得到人们的关注，而随着研究的深入，人们发现ulp作为蛋白酶有着传统蛋白酶无法逾越的优势。美国lifesensors公司的tauseef r.butt团队对ulp进行了系统的研究。发现ulp在宽温度区间、宽ph区间、多种缓冲液条件下均有很高的活性，对很多化学试剂耐受，甚至在较高浓度的变性剂环境中都能保持较高活性，而且与sumo融合的目的蛋白n端残基除pro外其他氨基酸对ulp酶切sumo标签都没有影响。

4、与传统序列专一性蛋白酶不同，ulp的酶活力非常高，一般ulp与底物比率在1:5000时都可以很好的酶切，甚至比率可以达到1:10000。另一方面，即使将ulp与底物比率调整为1:1，ulp也不会出现非特异性切割。

5、由于sumo和ulp均来源于酵母，虽然在大肠杆菌中能实现重组表达，但由于是异源蛋白，表达量比较低，限制了sumo融合系统的拓广。

6、在公开号为“cn102234640a”，名称为“重组小分子泛素样修饰物蛋白酶及其制备方法和应用”的中国专利申请中，提供了一种带有gst标签的sumo蛋白酶的构建及其制备方法；在专利cn201610560872.2中，公布了直接表达sumo蛋白酶基因及分别含有6种标签的sumo蛋白酶基因的构建。

7、以上专利虽然都能获得较好的sumo蛋白酶表达，但存在以下一些技术问题：

8、1)上述专利中使用的标签蛋白主要作用是促进蛋白的可溶性表达，并可针对标签蛋白使用特定亲和层析方式纯化sumo蛋白酶，但使用蛋白标签对sumo蛋白酶对蛋白活性的提升没有正面影响；

9、2)通常来说，以上专利中如需获得不含标签的sumo酶蛋白，则需使用相应的蛋白酶切除对应标签蛋白，无形中会增加纯化步骤及纯化成本。

10、针对以上问题，本发明采用的标签为sumo标签，在纯化中可以通过简单亲和层析得到高纯度蛋白，同时在表达纯化过程中可以进行自我酶切，得到不含标签的sumo蛋白酶，得到的sumo蛋白酶纯度高，活性比市售产品高50％左右。本发明构建的大肠杆菌菌株，表达方式为胞内可溶表达，且表达量在25％以上的sumo蛋白酶工程菌株，使sumo蛋白酶ulp在大肠杆菌中高水平表达，降低了sumo蛋白酶的生产成本。

技术实现思路

1、本发明的目的是解决现有技术存在的技术问题，提供一种sumo蛋白酶重组表达载体、表达sumo蛋白酶的工程菌、其构建方法及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

3、在本发明的第一方面，提供了一种sumo蛋白酶基因，由sumo标签、ulp1序列和多聚组氨酸标签组成，所述的sumo蛋白酶基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。所述的sumo蛋白酶基因用于编码一种新的高活性的sumo蛋白酶。

4、本发明中，sumo标签所起的作用是通过标签与sumo蛋白酶融合，促进sumo蛋白酶折叠，增强sumo蛋白酶的可溶性表达，保护sumo蛋白酶免受蛋白酶水解，提高sumo蛋白酶的稳定性；多聚组氨酸标签是为了作为亲和层析的标签，方便蛋白纯化。

5、在本发明的第二方面，提供了一种含有如第一方面所述sumo蛋白酶基因的重组表达载体。

6、所述的表达载体是将第一方面所述的核苷酸序列如seq id no.2所示的sumo蛋白酶基因导入表达质粒构建而成，

7、所述ulp1的氨基酸序列为截取酿酒酵母来源的sumo酶ulp1蛋白序列(genbank：kaf1908775.1)的第402-621位氨基酸(seq id no.1)。

8、所述表达载体表达的氨基酸序列如seq id no.3所示。

9、优选地，所述表达质粒为pet28、pet21、pet24或pet31。

10、在本发明的第三方面，提供了一种高效表达sumo蛋白酶的工程菌，所述的重组工程菌株是由第二方面所述表达载体转化宿主菌制得。

11、优选地，所述的宿主菌为e.coli bl21(de3)、e.coli dh5a或e.coli rosetta。

12、在本发明的第四方面，提供了一种高效表达sumo蛋白酶的工程菌的构建方法，包括如下步骤：

13、1)通过pcr扩增的方式获得由sumo标签、ulp1序列和多聚组氨酸标签组成的sumo蛋白酶基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示；

14、2)将步骤1)获得的sumo蛋白酶基因与表达质粒分别双酶切后连接，获得含有sumo蛋白酶基因的重组质粒；

15、3)制备宿主菌感受态细胞，取步骤2)的质粒转化宿主菌，筛选阳性克隆，得到高效表达sumo蛋白酶的重组工程菌。

16、优选地，所述表达质粒为pet28、pet21、pet24或pet31。

17、优选地，所述的宿主菌为e.coli bl21(de3)、e.coli dh5a或e.coli rosetta。

18、在本发明的一个优选方式中，所述高效sumo蛋白酶的工程菌的构建方法，包括如下步骤：

19、1)分别设计上下游引物f1(seq id no.4)和r1(seq id no.5)，以核苷酸序列为seq id no.2的sumo蛋白酶基因为模板，进行pcr扩增，获得带有sumo标签、ulp1序列和多聚组氨酸标签组成的sumo蛋白酶基因扩增产物，扩增产物命名为1901-1；

20、2)将步骤1)的pcr扩增产物1901-1与pet28a质粒分别使用限制性内切酶ncoi和bamhi进行双酶切后连接，得到编码sumo蛋白酶基因的重组质粒，连接产物命名为pet28-1901-1；

21、3)使用步骤2)的连接产物pet28-1901-1转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，得到能够高效表达sumo蛋白酶的重组工程菌株，重组工程菌株命名为bl21(de3)/pet28a；

22、所述的步骤1)中，涉及的引物序列如下表所示：

23、

24、在本发明的第五方面，提供了上述第四方面所述高效表达sumo蛋白酶的工程菌在制备sumo蛋白酶中的应用。

25、本发明具有如下技术效果：

26、1)sumo标签能够促进目的蛋白折叠，提高蛋白产量。带sumo标签的sumo蛋白酶基因能促进sumo蛋白酶在大肠杆菌胞内充分折叠，提高sumo蛋白酶蛋白在破菌后上清的溶解度；同时在表达纯化过程中，sumo标签会被sumo蛋白酶自行酶切，并被纯化去除，最终得到不含sumo标签的sumo蛋白酶。

27、2)构建的sumo蛋白酶基因中除了带有sumo标签，还带有his亲和标签，可通过亲和层析较简单的得到纯度95％以上的的sumo蛋白酶蛋白。

28、3)从本发明的实施例可以看出，将获得的含有sumo标签的sumo蛋白酶基因的工程菌进行发酵培养，破菌离心后将上清通过离子交换、亲和等纯化方式获得sumo蛋白酶蛋白。对蛋白进行sds-page、n末端序列检测，发现电泳纯度达95％以上，且分子量和n末端序列正确。经活性检测，产品活性较市售sumo蛋白酶活性高。