一种GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法与流程

一种gmp车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法
技术领域
1.本发明涉及外泌体制备领域，具体为一种gmp车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法。


背景技术：

2.外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，近年来对外泌体递送药物研究越来越频繁，外泌体递送药物到指定的细胞对医学领域起到重要的研究意义，常规的提取方式有密度梯度离心、差速离心、sec、亲和纯化等，虽然差速离心是提取金标准，但是提取步骤需要4-5步，十分耗时，不可扩展，且多次离心不仅会降低得率也会破坏外泌体的完整性。以上所述，现有技术中的外泌体提取工艺提取效率低，且难以保证具有高纯度和高浓度的效果。


技术实现要素：

3.针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种gmp车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题,本发明减少了外泌体提取的时间，提取的纯度和浓度更高，设备需求低。
4.为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种gmp车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法，该方法包括如下步骤：
5.(1)间充质干细胞培养：间充质干细胞提取后，用间充质干细胞无血清培养基将细胞置于37℃，5％co2条件下培养。
6.(2)细胞上清预处理：将待提取的外泌体样本经过离心除去大颗粒杂质。样本离心为3000-10000g，4℃离心15-20min，弃沉淀，留取上清1-50ml。
7.(3)超滤管浓缩：超滤管离心对样本进行浓缩的同时去除杂蛋白。样本放入超滤管后设置离心力为3500g，4℃离心20-30min，留取截留上清1-50ml。
8.(4)sec纯化：样本过sec分子筛层析柱中，收集外泌体馏分。排空sec柱内缓冲液后，加入样本，待样本完全进去柱内，加入等体积(1-5ml)生理盐水，开始接馏分。重复加入等体积生理盐水，接取对应馏分(1-5ml)。
9.(5)超滤管再次浓缩：收集馏分再次用超滤管离心浓缩得到高纯度，高浓度外泌体。将含有外泌体的馏分混合后(1-15ml)，用超滤管再次离心浓缩得到外泌体(200ul-5ml)。
10.进一步的，所述间充质干细胞置于37℃，5％co2条件下，利用无血清培养培养，传至6-8代。
11.进一步的，使用的离心机可调节温度为4℃，离心力可达到3500-10000g。
12.进一步的，膜尺寸在30-500kd，可有效截取外泌体。
13.进一步的，sec柱体积12-60ml。
14.进一步的，所述间充质干细胞包括分离原代间充质干细胞，并细胞达到一定融合
度，在超净台中，弃去t-25瓶中的培养液，加入适量的dpbs清洗细胞后，弃去，再加入1ml干细胞温和消化酶消化细胞，消化时间2～5min。
15.进一步的，在镜下观察到细胞状态合格后加入细胞培养上清或完全培养基稀释细胞悬液。用移液器轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。
16.进一步的，将细胞悬液转移到15ml离心管中，离心弃上清，加入适量无血清培养基，重悬细胞后接入新的培养瓶中，确保细胞均匀分布。
17.进一步的，分离原代间充质干细胞通过采用植块法或酶消化法，所述ec柱料直径26.6mm，柱高134.8mm，填料高100mm。sec层析柱上样量为5ml细胞上清，sec层析柱洗脱液为生理盐水。sec层析柱收集馏分2-5，共收集体积为20ml。
18.进一步的，细胞融和度达80％，弃培养基，所述细胞状态在镜下观察到细胞全部收缩变圆，且有少量细胞开始流动时，即为合格状态，此时立即加入温和酶使用量2倍体积(2ml)的细胞培养上清或完全培养基稀释细胞悬液。
19.本发明的有益效果：
20.1.该gmp车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法可以得到优于市面纯度的外泌体，条件温和，得到的外泌体完整性有保障。
21.2.该gmp车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法耗时短，分离纯化时间只需要15分钟；操作简便，无需特殊设备。
22.3.该gmp车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法重复性好，且纯度高；缓冲液体系，对下游实验无干扰等优点。同时能够解决工业化外泌体的提取，方便下游的各种外泌体研究和临床医学使用。
附图说明
23.图1为本发明一种gmp车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法的外形的流程图；
24.图2为本发明中sec纯化细胞上清外泌体馏分bca蛋白鉴定；
25.图3为本发明中最后超滤浓缩细胞上清得到外泌体wb鉴定；
26.图4为本发明中最后超滤浓缩细胞上清得到外泌体nta鉴定；
27.图5为本发明中最后超滤浓缩细胞上清得到外泌体电镜鉴定。
具体实施方式
28.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
29.请参阅图1至图5，本发明提供一种技术方案：一种gmp车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法，包括以下主要步骤：一、间充质干细胞的培养；二、细胞上清预处理；三、超滤管浓缩；四、sec纯化；五、超滤管再次浓缩，具体的，酶消化法分离原代间充质干细胞。待细胞融和度达80％，在超净台中，弃去t-25瓶中的培养液，加入适量的dpbs清洗细胞后，弃去，再加入1ml干细胞温和消化酶消化细胞，消化时间2～5min。在镜下观察到细胞全部收缩变圆，且有少量细胞开始流动时，立即加入温和酶使用量2倍体积(2ml)的细胞培养上清或完全培养基稀释细胞悬液。用移液器轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混
匀，使细胞完全分散。将细胞悬液转移到15ml离心管中，1300rpm(300g)离心5min，弃上清，加入适量无血清培养基。重悬细胞后接入新的培养瓶中，确保细胞均匀分布，细胞密度达到为8000cells/cm2。
30.本实施例，将细胞置于37℃，5％co2条件下，无血清培养基培养并传代至第6代。收集间充质干细胞上清2-6代，离心条件为10000g，4℃离心30min。留上清，弃沉淀。上清用于后续外泌体提取。将离心后的上清转入超滤管中，3500g，4℃离心20min，取截留液体。取截留浓缩液5ml加入sec预装柱，预装柱高度为100mm，上样开始后进行馏分的收集，总共收集1-10号馏分。馏分收集完成之后用生理盐水清洗sec层析柱，清洗完成之后用20％乙醇保存层析柱。收集馏分2-5馏分进行合并，每个馏分5ml，收集20ml的外泌体。合并的20ml外泌体馏分，用超滤管3500g，4℃离心超滤后，高纯度，高浓度外泌体。取出超滤管中外泌体，短期存放4℃，长期保存建议存放-80℃。随后用生理盐水清洗超滤管，完成之后用20％乙醇保存超滤管。
31.本实施例，对sec收集的馏分bca蛋白定量检测，包括以下步骤：配制工作液:根据标准品和样品数量，按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b(50:1)配制适量bca工作液，充分混匀。稀释标准品：取10微升标准品用pbs稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加pbs补足到20微升。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加pbs到20微升。各孔加入200微升bca工作液，37℃放置30分钟。
32.本实施例，用酶标仪测定a562，根据标准曲线计算出蛋白浓度：如图2所示细胞上清提取外泌体过sec柱后各馏分蛋白浓度。通过bca测定各个馏分蛋白的含量，从第6个馏分开始蛋白含量急剧增加，根据大分子从柱料外流出时间短，小分子从柱料内流出时间长的特征，从而判定外泌体集中在馏分6之前，馏分1蛋白含量很低，应为柱料缓冲液，判定外泌体在馏分2-5。
33.本实施例，对第二次过超滤管浓缩的外泌体进行western blot鉴定，其步骤包括：配胶：用商品化试剂盒配置15％的下层胶和上层胶；制样：取10ul外泌体加入10ul 2
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sds上样缓冲液，混匀在100℃桌面加热器上加热10min；点样：取10ul煮过的样品128v15a的电流下2h进行跑胶蛋白分离；转膜：将胶上的样品通过湿转的方式在300a电流45min转移到pvdf膜上；染色与读片：将显色剂a与显色剂b分别取1ml混合，将pvdf膜进行染色，染色5min在显色液中读取wb条带位置。
34.本实施例，通过对外泌体的表面蛋白cd9，cd81.tsg101,以及阴性对照calnexin蛋白进行wb条带鉴定，如图3所示，以此来鉴定外泌体。
35.本实施例，对第二次过超滤管浓缩的外泌体进行nta鉴定。其步骤包括：用水对精纯的外泌体稀释200倍，然后在nta检测仪上405nm激光条件下拍摄外泌体的布朗运动的轨迹，测定外泌体的粒径和浓度。如图4所示，通过对精纯的外泌体粒径进行检测，粒径在141.5nm，测定浓度1.2e+10particles/ml。
36.本实施例，对第二次过超滤管浓缩的外泌体进行电镜鉴定，其步骤包括：取适量外泌体在戊二醛中固定，将5-10ul外泌体滴加到铜网上，室温吸附10min左右，用滤纸吸附多余的液体，然后向铜网上滴加10ul 2％磷钨酸溶液，在室温下对外泌体染色处理2min，小心用滤纸吸去多余的滤液，在铜网室温下晾干，电压120kv下观察外泌体。如图5所示通过电镜
观察，在200nm电镜观察到完整的外泌体囊泡形状。通过上述方法的鉴定，脐带间充质干细胞上清可以提取到高纯度，高浓度的外泌体。
37.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
38.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。