靶向STAT3蛋白Tyr705磷酸化的肽及其应用

靶向stat3蛋白tyr705磷酸化的肽及其应用
技术领域
1.本技术属于stat3蛋白磷酸化检测技术领域，本技术公开了靶向stat3蛋白tyr705磷酸化的抗原肽及其应用，具体而言涉及能够将肽作为抗原制备靶向识别stat3蛋白tyr705磷酸化的抗体及其作为检测stat3蛋白tyr705磷酸化水平的应用。


背景技术：

2.信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,stat)是一种具有dna结合活性的蛋白质家族，包括stat1～stat6。其中，stat3是该家族中唯一的胚胎致死的核转录因子，其影响超过1000个基因产物的表达。
3.stat3蛋白结构包括n-末端结构域、dna结合域、卷曲螺旋结构域、sh2结构域、c-末端转录激活结构域，其中sh2结构域最为保守。当细胞受到营养、炎症、生长信号等刺激时，stat3蛋白的tyr705位点受jak激酶催化发生磷酸化，促使两个stat3单体发生二聚化，由细胞质转位至细胞核，进而参与靶基因的转录调控。因此，通过检测细胞中stat3蛋白的tyr705位点磷酸化水平，可以间接探究细胞生长、增殖、代谢、炎症等生物学过程。
4.目前，现有技术主要通过stat3蛋白tyr705磷酸化抗体(例如cell signaling technology/cst公开的cat.9145的抗体)及其抗体试剂盒来检测stat3蛋白tyr705磷酸化水平。然而，ncbi数据库显示，stat3根据基因内含子的不同剪接而产生四种不同的蛋白亚型：α亚型、β亚型，αδs701亚型、βδs701亚型，现有技术提供的抗体不能有效地检测stat3蛋白αδs701亚型、βδs701亚型的tyr705磷酸化水平。


技术实现要素：

5.在此基础上，本技术发明人对stat3蛋白的不同亚型进行了深入研究(如图1所示)，stat3基因在其第21位内含子存在一隐含剪接位点，该位点的可变剪接产生的两种蛋白亚型仅有是否包含第701位丝氨酸(ser701)的差异，从而进一步将stat3蛋白分为不含ser701的亚型(后文简称δs701亚型)、以及含有ser701(简称fl亚型)两种亚型。而人类细胞中存在stat3δs701亚型约占stat3总数的17％～22％。然而，现有的商业化抗体(例如cat.9145，cell signaling technology，cst)无法识别stat3蛋白δs701亚型的tyr705磷酸化信号。为此，本技术实施例至少公开了如下技术方案：
6.第一方面，本技术实施例公开了一种抗原肽，所述抗原肽具有靶向stat3蛋白fl亚型和δs701亚型的tyr705磷酸化位点的免疫原性，其中，所述抗原肽具有如(i)～(iii)中的至少一项所示的氨基酸序列：
7.(i).seq id no.6～9所示的氨基酸序列；
8.(ii).与(i)所述序列至少具有75％相似性的氨基酸序列；
9.(iii).具有与(i)或(ii)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸序列获得的氨基酸序列，且与(i)或(ii)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
10.(iv).(i)、(ii)或(iii)所述抗原肽或在其氨基酸序列中的部分或全部氨基酸残基处被修饰。
11.第二方面，一种抗原构建体，所述抗原构建体包含第一方面抗原肽及用于负载或偶联所述第一方面的抗原肽的载体。
12.第三方面，本技术实施例还公开了第一方面所述的抗原肽及第二方面所述的抗原构建体的应用，所述应用包括如下至少一项：
13.(1)制备stat3蛋白的tyr705磷酸化特异性抗体；
14.(2)制备stat3蛋白的tyr705磷酸化相关疾病的疫苗；
15.(3)用作炎症性疾病治疗药物；
16.(4)共刺激分子拮抗剂；
17.(5)免疫抑制剂。
18.第四方面，本技术实施例公开了一种抗体，所述抗体与第一方面所述的抗原肽、或与第二方面所述的构建体进行特异性结合。
19.第五方面，本技术实施例公开了第四方面所述抗体的制备方法，包括将第一方面所述的抗原肽、或与第二方面所述的构建体进行动物免疫，收集抗血清和纯化的步骤。
20.第六方面，本技术实施例公开了一种elisa试剂盒，所述elisa试剂盒包括第四方面所述的抗体，所述elisa试剂盒用于检测stat3蛋白δs701亚型和fl亚型的tyr705位点的磷酸化水平。
21.第七方面，本技术实施例公开了一种药物组合物，其包括第四方面所述的抗体，以及药学上可接受的辅料或者载体。
22.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果之一：
23.本技术实施例公开的抗原肽具有stat3蛋白tyr705磷酸化的免疫原性，其能够在体内产生免疫应答，进而产生一种能够同时特异性识别各种stat3蛋白亚型ptyr705的磷酸化抗体，从而极大地提高对stat3蛋白ptyr705的检测覆盖率。
附图说明
24.图1为本技术提供的各物种中stat3蛋白αfl、αδs701、βfl和βδs701亚型的存在情况。
25.图2为本技术实施例提供的人类细胞中存在stat3蛋白δs701亚型及含量分析结果图。
26.图3为本技术实施例提供的磷酸化抗原肽hplc纯度测定结果。
27.图4为本技术实施例提供的非磷酸化抗原肽hplc纯度测定结果。
28.图5为本技术实施例提供的不同stat3蛋白突变体的表达质粒电泳图(a)、测序比对图(b)以及自制抗体与商用抗体检测不同stat3蛋白亚型的westernblot检测图(c)；
29.图5a中，从左至右的泳道依次为marker、pcdna3.1-gfp、pcdna3.1-gfp-stat3-fl、pcdna3.1-gfp-stat3-δs701和pcdna3.1-gfp-stat3-y705f；图5b中为pcdna3.1-gfp-stat3-fl、pcdna3.1-gfp-stat3-δs701和pcdna3.1-gfp-stat3-y705f的测序比对结果图；图5c中，泳道1、2、3所示均为pcdna3.1-gfp-stat3-fl转染hela细胞所得细胞裂解液作为样品的wb检测结果，泳道4所示均为pcdna3.1-gfp-stat3-δs701转染hela细胞所得细胞裂解
液作为样品的wb检测结果，泳道5所示均为pcdna3.1-gfp-stat3-y705f转染hela细胞所得细胞裂解液作为样品的wb检测结果。
具体实施方式
30.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。本技术中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
31.根据stat3基因第21内含子和第23位内含子的不同剪接方式，可将stat3蛋白分为含第701位丝氨酸的α亚型(简称为stat3αfl)、不含第701位丝氨酸的α亚型(简称为stat3αδs701)、含第701位丝氨酸的β亚型(简称为stat3βfl)和不含第701位丝氨酸的β亚型(简称为stat3βδs701)。为研究人类细胞中不同stat3蛋白的亚型比例，本技术发明人进行了如下试验：
32.该试验步骤主要包括通过对stat3αfl(ncbi序列号：nm_139276.3)和stat3αδs701(ncbi序列号：nm_003150.4)、stat3βfl(ncbi序列号：nm_001369517.1)和stat3βδs701(ncbi序列号：nm_001369519.1)的mrna序列的第701位丝氨酸(ser701)差异位点进行检测，以确定人类细胞中存在stat3δs701亚型的比例。利用第701位丝氨酸(ser701)的差异，以及ser701处存在一限制性内切酶(afeⅰ)的单一识别位点(-agcgct-)，进行pcr扩增获得包含ser701区域的cdna片段，再利用afei酶切后剩余dna条带与酶切产物大小不同进行区分，酶切原理示意图见图2a。
33.1、质粒afeⅰ酶切
34.以pcdna3.1质粒为基础，分别构建表达stat3αfl、stat3αδs701、stat3βfl和stat3βδs701的重组质粒，然后使用afeⅰ(new england biolabs，neb,cat.r0652s)对重组质粒进行酶切，按照如表1所述的酶切反应体系添加试剂后，于37℃反应90min，65℃处理20min使酶失活。取酶切前、酶切后样品各0.2μg，使用1.5％浓度琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为135v，45min。重复实验三次。结果如图2b所示，afeⅰ内切酶可以特异性识别并充分切割fl亚型的stat3，而不能切割δs701亚型的stat3。
35.表1
36.试剂使用量10
×
cutsmart5μldna1μgafeⅰ1μlddh2oto 50μl
37.2、细胞样品afeⅰ酶切
38.将l02、hepg2、a549、hek-293t、hela细胞传代至六孔板内，培养于含10％胎牛血清的dmem培养基中，在5％的co2培养箱中生长至细胞密度为90％左右时，弃去培养基，加入1ml trizol裂解液裂解细胞，并抽提rna，取1μg rna逆转录为cdna。以细胞cdna为dna模板进行扩增，使用引物序列为：afeⅰf:5
’‑
tccgtggaaccatacacaaa-3’，如seq id no.1所示；afeⅰcellr:5
’‑
ttatttccaaactgcatcaatgaa-3’，如seq id no.2所示。pcr反应体系如下表2
所示，反应程序如表3所示。
39.表2
40.试剂使用量takara taq version 2.025μl模板cdna4μlafeⅰf(10μm)1μlafeⅰcellr(10μm)1μlddh2oto 50μl
41.表3
42.步骤温度时间198℃5min298℃10sec358℃30sec472℃45sec 重复步骤2-434个循环572℃5min64℃∞
43.对上述pcr产物进行dna片段纯化(takara,cat.9761)，检测纯化效果，使用琼脂糖凝胶电泳检测纯度，使用超微量核算蛋白测定仪检测浓度。使用afeⅰ(new england biolabs，neb，cat.r0652s)对纯化产物进行酶切，酶切反应体系及酶切结果检测实验方法与质粒酶切相同，重复实验三次。结果如图2c所示，为人类细胞中stat3片段的afeⅰ酶切结果实验结果，实验结果显示，人类细胞中存在stat3αδs701/βδs701亚型，且占比不低。
44.3、实时荧光定量pcr(qpcr)
45.根据stat3αfl/βfl和stat3αδs701/βδs701的mrna和cdna序列在701位丝氨酸(ser701)的差异，设计特异性引物，以stat3αfl/αδs701质粒为qpcr实验dna模板，检测引物特异性，每个样品重复三次；以上述细胞样品cdna为dna模板，进行qpcr实验，每个样品重复3次。结果如图2d所示，人类细胞中存在stat3δs701亚型，且约占总数的17％～22％。
46.qpcr使用引物序列为：afeⅰf：5
’‑
tccgtggaaccatacacaaa-3’,如seq id no.1所示；fl qp r：5
’‑
ttcaggtatggggcagcgctac-3’,如seq id no.3所示；δs qp r：5
’‑
ttcaggtatggggcagcgcctg-3’,如seq id no.4所示；total qp r：5
’‑
gctctctggccgacaatact-3’,如seq id no.5所示。
47.表4 qpcr反应体系(莫纳生物，ref：mq00401)
48.试剂使用量monampchemohs qpcr mix10μl模板cdna1μl正向引物(10μm)0.4μl反向引物(10μm)0.4μlhigh rox dye(100
×
)0.2μl
nuclease-free waterto 20μl
49.表5 qpcr反应扩增程序
50.步骤温度时间195℃30sec295℃10sec360℃30sec 重复步骤2-339个循环495℃15sec560℃15sec695℃15sec
51.另外，对公开可获得的rna-seq数据(geo登录号gse30611)的分析表明，16种人体组织中的δs701亚型占stat3总量的10～26％。尽管stat3δs701亚型比fl亚型少，但δs701/stat3总量的比率在人类组织中保持相对恒定。stat3δs701亚型恒定的存在提示δs701在维持机体生理功能上是必不可少的。stat3的转录活性通过tyr705残基磷酸化来实现，因此研究δs701亚型在细胞因子刺激后tyr705磷酸化的变化对揭示δs701亚型的功能有着重要意义。而市售的应用最广泛的stat3tyr705磷酸化抗体(cell signaling technology/cst，cat.9145，引用文献数1669篇)不能识别人类细胞内stat3δs701亚型的tyr705磷酸化，严重阻碍了stat3δs701亚型的功能研究。
52.抗原肽
53.为此，本技术实施例公开了一种抗原肽，所述抗原肽是模拟stat3蛋白fl亚型和δs701亚型的tyr705磷酸化表位的抗原肽。该抗原肽能够在机体内产生免疫应答，进而产生一种能够同时特异性结合具有ptyr705的各种亚型stat3蛋白的抗体，从而极大地提高对stat3蛋白ptyr705的检测覆盖率。
54.该抗原肽具有靶向stat3蛋白的tyr705磷酸化位点的免疫原性，可以通过体内免疫制备一种可兼备识别stat3蛋白可变剪切体δs701亚型和fl亚型的ptyr705特异性抗体。由此可知，该抗原肽可以用于制备靶向stat3蛋白的tyr705磷酸化位点的相关疫苗和相关炎症疾病所用的药物等。该抗体可以用于检测细胞中的stat3蛋白的tyr705磷酸化位点的磷酸化水平，为探究细胞生长、增殖、代谢、炎症等生物学过程的分子机制提供检测方法。
55.为此，本技术实施例公开的所述抗原肽具有靶向stat3蛋白的tyr705磷酸化位点的免疫原性，其中，所述抗原肽为(i)～(iv)中的至少一项：
56.(i).seq id no.6～9所示的氨基酸序列；
57.(ii).与(i)所述序列至少具有75％相似性的氨基酸序列；
58.(iii).具有与(i)或(ii)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸序列获得的氨基酸序列，且与(i)或(ii)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
59.(iv).(i)、(ii)或(iii)所述抗原肽或在其氨基酸序列中的部分或全部氨基酸残基处被修饰。
60.本文中使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换，且定义为意指由通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。
61.术语“肽”是氨基酸(通常是l-氨基酸)的链，该氨基酸的α碳通过肽键连接，该肽键由一个氨基酸的α碳的羧基与另一氨基酸的α碳的氨基之间的缩合反应形成。链一端(即氨基端)的末端氨基酸具有自由氨基，而链另一端(即羧基端)的末端氨基酸具有自由羧基。因此，术语“氨基端”(缩写为n端)指肽的氨基酸端氨基酸上的自由α氨基，或指肽内任意其他位置上的氨基酸的α氨基(参与肽键时为亚氨基)。类似地，术语“羧基端”(缩写为c端)指肽的羧基端氨基酸上的自由羧基，或指肽内任意其他位置上的氨基酸的羧基。
62.本技术中，“其氨基酸序列中的部分或全部氨基酸残基处被修饰”，此类修饰的肽可以通过本领域中已知的任何方法来制备。例如，修饰的肽可以通过构成该肽的氨基酸残基的侧链的官能团的修饰来制备，所述修饰诸如酯化、烷基化、卤化、磷酸化、磺化或酰胺化。而且，多种物质可以与肽在n-和/或c-末端结合。例如，氨基酸、肽或其类似物可以与肽结合。当此物质与上述的“(i)、(ii)或(iii)所述抗原肽”结合时，可以通过任何方法，例如通过体内酶促反应或通过细胞内加工，来除去该物质，如此最终产生抗原肽。此种“修饰”的目的可以为调节肽的溶解度；改善肽的稳定性，诸如蛋白酶抗性；将肽递送至特定的组织或器官；或增加抗原呈递细胞对肽的摄取。例如，此种“修饰”的目的还可以是提高抗原肽的免疫原性，促进抗原肽与stat3蛋白tyr705磷酸化表位的特异性结合。
63.本文中使用的术语“功能相同或相似的氨基酸序列”或“功能片段”指具有与本文中定义的肽(例如，分别如seq id no.6～9中所示)基本上相同的(生物)活性的功能肽片段，即该片段仍能够在生物中，但尤其是在动物，尤其是哺乳动物或人内引起高特异性免疫应答(即具有免疫原活性)，以产生能够特异性识别和结合stat3蛋白fl亚型和δs701亚型的tyr705磷酸化表位的抗体。
64.本文中用术语“残基”来指通过酰胺键掺入肽中的氨基酸。因此，氨基酸可以是天然存在的氨基酸，或者，除非另有限制，可以包含以类似于天然存在的氢基酸的方式发挥作用的天然氨基酸的已知类似物(即氨基酸类似物)。
65.为了保持stat3蛋白tyr705磷酸化表位的免疫原性，可以修饰(添加、缺失和/或取代)少数(例如，1个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。这里，术语“数个”意指7个以下的氨基酸，如6个或5个以下。要被修饰的氨基酸的百分比优选为20％以下，更优选15％以下，更优选10％以下，进一步更优选或1-5％。
66.本领域技术人员应当理解的是，改变氨基酸序列中的单个氨基酸或少数百分比氨基酸的个别添加、缺失或取代会导致原始氨基酸侧链的特性得以保留。因此其被称作“保守替代”或“保守修饰”，该改变意指用化学上相似的氨基酸取代氨基酸，其中对蛋白质的改变导致具有类似的功能的蛋白质。提供功能上相似的氨基酸的保守性取代表为本领域公知。以下1)～8)项各自包含互为保守性取代的氨基酸：
67.1)丙氨酸(a)，甘氨酸(g)；
68.2)丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；
69.3)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；
70.4)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；
71.5)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；
72.6)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；
73.7)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；和
74.8)半胱氨酸(c)，甲硫氨酸(m)。
75.此类保守修饰肽也被视为本发明的肽。然而，本发明的肽不限于此，可包括非保守修饰，只要该肽保留原始肽的stat3蛋白tyr705位点磷酸化的免疫原性。
76.在本技术的某些实施例中，所述抗原肽的氨基酸序列如seq id no.6～9所示，如表6所示。表6中还示出了用于对比试验的对照肽的氨基酸序列，如seq id no.10～13所示。表6中，“p
‑”
表示该位点的氨基酸残基被磷酸化，
“‑
nh
2”表示该位点的氨基酸残基被酰胺化。
77.表6
78.抗原肽序列信息磷酸化肽1cdpgaap(p-y)lktkf-nh2，如seq id no.6所示磷酸化肽2adpgaap(p-y)lktkfic，如seq id no.7所示磷酸化肽3ceadpgaap(p-y)lktkf-nh2，如seq id no.8所示磷酸化肽4cdpgaap(p-y)lktkfic-nh2，如seq id no.9所示对照肽1cdpgaapylktkf-nh2，如seq id no.10所示对照肽2adpgaapylktkfic，如seq id no.11所示对照肽3ceadpgaapylktkf-nh2，如seq id no.12所示对照肽4cdpgaapylktkfic-nh2，如seq id no.13所示
79.另外一方面，本技术实施例公开了一种抗原构建体，所述抗原构建体包含第一方面的抗原肽及用于负载或偶联所述第一方面的抗原肽的载体。该载体尤其是还具有作为产生超分子抗原构建体的佐剂的功能性的载体。在某些实施例中，通过附着在例如脂质体上或重构在例如脂质体中来修饰根据第一方面的抗原肽，以产生wo公开wo2005/081872中所述的“超分子抗原构建体”，该wo公开的描述在此以其整体引入作为参考。如此得到的“超分子抗原构建体”使得其表面上显示独特的抗原肽呈递，该呈递导致增强的抗原暴露，并最终导致显示高构象敏感度的抗体的产生。具体而言，通过与便于插入脂质体载体/免疫佐剂的脂双层的亲脂或疏水部分结合来修饰根据本技术的抗原肽，尤其是通过作为肽在脂质体双层中的锚发挥作用，且具有导致肽靠近脂质体表面定位和稳定化的尺寸的亲脂或疏水部分。
80.在一些实施例中，亲脂或疏水部分是脂肪酸、甘油三酯或磷脂，尤其是含有c12和c24之间的碳链的脂肪酸、甘油三酯或磷脂，但尤其是棕榈酸。
81.在一些实施例中，通过至少两分子棕榈酸与该抗原肽的n端和c端末端共价结合和通过脂质体载体中重构来对本技术的抗原肽进行修饰。
82.在一些实施例中，缀合物中的肽各与四分子棕榈酸偶联；因此它们是四棕榈酰化的。
83.在一些实施例中，两分子棕榈酸与肽的n端末端偶联，两分子棕榈酸与肽或片段的c端末端偶联。
84.在一些实施例中，本技术提供根据本技术的抗原肽，其通过与亲脂或疏水部分，例如棕榈酸结合来修饰并重构在脂质体中，其中该脂质体制剂可以还包含产生超分子抗原构建体的佐剂，例如脂质a、明矾、磷酸钙、白细胞介素1和/或多糖和蛋白质的微囊，尤其是去毒脂质a，如单磷酰或二磷酰脂质a，或明矾。
85.在本技术的一个实施例中，本技术涉及的超分子构建体，其每个载体分子包含本技术中所述的一个或多个抗原肽，尤其是两个或多个抗原肽。
86.在本技术的一个实施例中，该载体分子是脂质体。
87.在一些实施例中，本技术涉及的超分子构建体和如本文中所述的超分子构建体，其每个载体分子包含两个或多个seq id no.6～9任一的抗原肽的组合。
88.在本技术的“超分子抗原构建体”中，脂质体可以具有双重功能，其可以用作包含之前本文中所述的超分子构建体的载体，同时作为佐剂发挥作用来在待用本技术的治疗性疫苗治疗的靶动物或人内增加或刺激免疫应答。还应理解，本技术的超分子抗原构建体组合物可以进一步包含其他佐剂，其包括但不限于匙孔槭血蓝蛋白(klh)、牛血清白蛋白(bsa)、鸡卵白蛋白(ova)、牛甲状腺球蛋白(thy)和其他佐剂，例如脂质a、明矾、磷酸钙、白细胞介素1，和/或多糖和蛋白质的微囊，但尤其是去毒脂质a，如单磷酰或二磷酰脂质a，或明矾；其他防腐剂；稀释剂；乳化剂；稳定剂；和已知并用于现有技术的疫苗中的其他成分。此外，可以将本领域已知的任意佐剂系统用于本技术的组合物中。这类佐剂包括但不限于弗氏不完全佐剂；弗氏完全佐剂；多分散β-(1,4)连接乙酰化甘露聚糖；聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物佐剂；修饰的脂质佐剂；皂苷衍生物佐剂；灭活百日咳毒素；血蓝蛋白；b群脑膜炎球菌外膜蛋白；绿脓杆菌外毒素a；霍乱毒素b亚单位；细菌外膜蛋白；大肠杆菌热敏感肠毒素；肺炎球菌溶血素；淋球菌菌毛蛋白；革兰氏阴性菌的脂多糖(lps)；大的聚合阴离子，如硫酸葡聚糖；和无机凝胶，如明矾、氢氧化铝或磷酸铝。
89.在本技术的某些实施例中，可根据化学领域中通常所用的合成方法和/或生物合成第一方面所述的肽。
90.本文中术语“分离的”指实质上或本质上游离于见于它的天然状态中的正常伴随它的成分的物质。因此，本文中所述的肽不包含正常情况下与它们的原位环境结合的物质。例如，通过银染凝胶上的条带强度测量，本文中所述的分离的免疫原肽至少约hplc 90％(纯)。
91.可以通过本领域公知的许多方法来显示蛋白质纯度或同质性，如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳后通过染色显示。为了某些目的，将需要高分辨率，利用hplc或类似的手段进行纯化。
92.当免疫原肽的长度相对短(即少于约50个氨基酸)时，通常用标准的化学肽合成技术合成它们。例如，采用本领域技术人员熟知的固相合成方法，固相合成是用于化学合成本文中所述的免疫原肽的优选方法，其中将序列的c端氨基酸与不可溶支持物连接，然后连续添加序列中的其余氨基酸。
93.例如，在一个实施例中，参照“基于fmoc策略的o-磷酸化多肽化学合成研究[j]高等学校化学学报,第2001年第s1期”提供的经典的fmoc固相合成方法，以亚磷酰胺为磷酸化试剂，以单体磷酸化法合成了具有如seq id no.6～13所示的氨基酸序列中的磷酸化氨基酸酸，并且参照“l-脯氨酰胺的合成新工艺[j]山东工业技术,第2016年，第9期”合成其中碳端的酰胺化氨基酸，再以fmoc固相合成方法依次合成如seq id no.6～13所示的氨基酸序列的多肽，并经过纯化的了hplc纯度均大于90％的冻干品(结果如图3和图4所示)。
[0094]
备选地，可以采用本领域技术人员熟知的重组表达的生物合成方法与化学修饰相结合的方法得到本文中所述的抗原肽。一般而言，这涉及产生编码肽的核酸序列，将核酸在
特定启动子控制下放置在表达盒中，在宿主中表达肽，分离所表达的肽，并根据需要复性肽。足以指导技术人员完成这类方法的技术见于文献中。本领域熟知地，通过宿主表达的免疫原肽，即可以按照包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等的标准方法纯化重组肽。对于用作治疗剂，优选约50％至95％同质性，且最优选80％至95％或更大同质性的基本上纯的组合物。
[0095]
抗体
[0096]
另外一方面，本技术实施例还公开了一种抗体，其与上述实施例公开的抗原肽可以进行特异性的免疫反应。具体的，该抗体可以通过将抗原肽、或抗原构建体作为抗原注射体内，引起免疫应答而制得。
[0097]
在一些实施例中，该抗体的制备包括如下过程：
[0098]
1、抗原的制备
[0099]
本实施例中，将表6中的如seqidno.6～9所示的磷酸化肽1～4分别分别与钥孔戚血蓝蛋白(简称klh)偶联(偶联剂为sμlfo-smcc)作为免疫抗原；将表6中的磷酸化肽1～4及对照肽1～4分别与牛血清白蛋白(bsa)偶联(偶联剂为戊二醛)作为检测抗原；偶联方法参照“合成环瓜氨酸化蛋白短肽的免疫原性和致关节炎性研究[j]中国免疫学杂志，2017，第1期”。制备的抗原用磷酸缓冲盐溶液(pbs)将免疫抗原分别稀释为1mg/ml，分装冻存于-20℃冰箱。
[0100]
2、动物免疫
[0101]
分别在第1、15、29、43天，每种抗原取1ml加入1ml福氏完全佐剂，乳化(检验乳化程度：将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，若不散开，表明已达到要求)，颈背部皮下多点(至少8点)进行免疫，每种抗原免疫2只新西兰白兔(江苏艾菱菲)。第53天时，颈动脉采血，大量收集抗血清。兔血在4℃冰箱静置过夜，次日无菌操作，将兔血分装进50ml离心管内，4℃，10000rpm/min，离心30分钟，收集上清，即为免疫后抗血清，贮存于-20℃。
[0102]
3、抗体纯化
[0103]
使用磷酸化多肽及非磷酸化多肽分别制备亲和纯化柱，亲和纯化磷酸化特异性抗体。
[0104]
(1)分别将seqidno.6～9所示的磷酸化肽1～肽4分别连接到活化的sulfolink resin(货号20401，thermo fisher scientific)上，制备抗原亲和柱，1ml sulfolink resin偶联1mg多肽。
[0105]
(2)使用10倍柱体积pbs平衡亲和柱，流尽溶液；兔血清经0.45um滤膜过滤。
[0106]
(3)血清过抗原亲和柱，流尽溶液，收集流穿。
[0107]
(4)10倍柱体积pbs平衡，流尽溶液。
[0108]
(5)加入5ml抗体洗脱液，分管收集洗脱液，每管1ml。
[0109]
(6)收集的洗脱液检测280nm处的吸光度，吸光度大于1.0的组分合并，对pbs透析。
[0110]
4、抗体效价检测
[0111]
采用紫外吸收法检测蛋白浓度，通过酶联免疫吸附法检测抗体效价。供试品为上述seqidno.6～9所示的磷酸化肽1～肽4分别制得的抗原免疫新西兰白兔后，经过上述纯化步骤的抗体，将抗体用包被稀释液稀释成1:1250、1:2500、1:5000、1:10000、1:20000、1:40000和1:80000的比例，按照下述如(1)～(6)所述的步骤进行。
[0112]
(1)包被：将包被抗原用包被缓冲液稀释为1ug/ml，加入酶标板中，每孔100ul，4℃孵育过夜。
[0113]
(2)封闭：将包被液弃去，每孔加入200ul封闭液(5％脱脂奶粉)，37℃静置孵育1.5小时。
[0114]
(3)加入待测样品：弃去封闭液，加入样品(血清或者抗体)，每孔100ul加入酶标板，37℃静置孵育1小时；用洗涤缓冲液冲洗10次，拍干孔内液体。
[0115]
(4)二抗孵育：酶标羊抗兔二抗用封闭液稀释至工作浓度，每孔100ul加入酶标板，37℃静置孵育30分钟；用洗涤缓冲液冲洗10次，拍干孔内液体。
[0116]
(5)显色：加入tmb显色底物：每孔100ul加入酶标板，37℃静置15分钟。
[0117]
(6)终止及读数：每孔加入50ul 2m h2so4终止反应，使用酶标仪od450nm读取数值。
[0118]
5、结果
[0119]
分别对利用seqidno.6～13所示的肽偶联牛血清白蛋白制备的检测抗原来检测生成的抗体效价。结果如表7所示。其中ag-1～4为使用seqidno.6～9所示的磷酸化肽偶联bsa制备的检测抗原，ag-control-1～4为使用seqidno.10～13所示的对照肽分别与bsa偶联制备的检测抗原。ab-1～4为使用seqidno.6～9所示的磷酸化肽1～4偶联血蓝蛋白，经动物免疫、抗体纯化等步骤获得的磷酸化抗体。结果显示stat3蛋白的tyr705磷酸化特异性抗体针对磷酸化多肽的elisa效价大于1：80000。
[0120]
表7od450nm值
[0121][0122][0123]
应用
[0124]
为此，本技术实施例实质上还公开了第一方面所述的抗原肽、第二方面的抗原构建体的应用。所述应用包括如下至少一项：
[0125]
(1)制备stat3蛋白的tyr705磷酸化特异性抗体；
[0126]
(2)制备stat3蛋白的tyr705磷酸化相关疾病的药物；
[0127]
(3)用作炎症性疾病治疗药物；
[0128]
(4)共刺激分子拮抗剂；
[0129]
(5)免疫抑制剂。
[0130]
另外，通过上述实施例提供的方法制得的抗体与模拟stat3蛋白tyr705位点磷酸化的肽6～9具有特异性结合，本技术实施例还提供了此种抗体应用于stat3蛋白tyr705位
点的磷酸化检测的试剂盒，进一步地，本技术实施例公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括本技术的抗体，所述试剂盒通过该抗体可以特异性地结合stat3蛋白δs701亚型和fl亚型的tyr705磷酸化表位，以实现检测样品中sta3蛋白的tyr705磷酸化水平。通过该抗体靶向识别细胞、组织或有机体的stat3蛋白tyr705位点，制备成免疫印迹试剂盒或elisa试剂盒以实现检测。
[0131]
在本技术的一些实施例中，该检测试剂盒包含包被有stat3蛋白δs701亚型和fl亚型的tyr705磷酸化抗体的酶标板、酶标抗体、洗涤缓冲液、封闭液、包被缓冲液、tmb显色液、终止液。在一个实施例中，本技术检测stat3蛋白δs701亚型和fl亚型的tyr705磷酸化的elisa检测试剂盒具体包括以下组分：
[0132]
stat3蛋白fl亚型和δs701 tyr705磷酸化抗体(上述实施例提供)；
[0133]
酶标抗体；
[0134]
洗涤缓冲液：pbst缓冲液：1000ml 0.01mol/l pbs+0.5ml tween-20；
[0135]
封闭液：含有5％脱脂奶粉pbs缓冲液；
[0136]
包被缓冲液：包含0.015m na2co3和0.035m nahco3，ph 9.6；
[0137]
tmb母液：10mg tmb充分溶于5ml无水乙醇；
[0138]
tmb显色液：包含0.5ml tmb母液、10ml底物缓冲液和2.1μl 30％质量百分含量的h2o2水溶液，使用是新鲜配制；以及
[0139]
终止液：2m的h2so4溶液。
[0140]
上述试剂盒可以用于识别stat3蛋白各种亚型的tyr705磷酸化，例如使用elisa方法检测第705位的tyr磷酸化stat3 fl亚型和δs701亚型蛋白或者其肽段。在一个实施例中，该检测试剂盒的制备方法还包括将stat3蛋白fl亚型和δs701 tyr705磷酸化抗体包被酶标板的步骤。
[0141]
在一个实施例中，利用上述制得的抗体对stat3蛋白tyr705位点的磷酸化检测步骤包括：
[0142]
(1)构建表达载体
[0143]
参见“pcdna3.1-gfp-lc3b真核表达载体的构建[j]安徽农业科学,2015第6期.”所示方法，分别构建含ser701的stat3蛋白表达载体pcdna3.1-gfp-stat3-fl、缺失ser701的stat3蛋白表达载体pcdna3.1-gfp-stat3-δs701和不能发生tyr705磷酸化的突变型pcdna3.1-gfp-stat3-y705f。这些表达质粒的琼脂糖凝胶电泳及测序比对结果分别如图5a和图5b所示。
[0144]
(2)构建真核表达细胞
[0145]
将hela细胞接种至六孔板内，培养于含10％胎牛血清的dmem培养基，并置于5％的co2培养箱中培养；当细胞生长至密度为60～70％左右时，取上述表达载体按常规脂质体转染法分别转染hela细胞；转染24小时后，实验组使用浓度为10ng/ml的il-6刺激30min后，收集细胞，即为分别表达具有stat3蛋白fl亚型、δs701亚型，以及y705f突变体的重组细胞。
[0146]
(3)免疫印迹检测
[0147]
收集上述各种细胞液，使用500μl加入蛋白酶抑制剂的ripa裂解液(碧云天生物技术，cat.p0013c)裂解细胞，按照ppase(new england biolabs，neb，cat.p0753s)说明书所示方法进行制样用于免疫印迹方法检测。对照组：使用ppase消化的细胞样品，消化结束后
的样品用于免疫印迹方法(western blot，后文简称wb)检测。
[0148]
结果如图5c所示，以cst为例的商用的ptyr705商用抗体不能识别stat3蛋白δs701亚型的ptyr705信号，自制抗体可以识别stat3蛋白fl亚型和δs701亚型的705位酪氨酸磷酸化信号。
[0149]
药物组合物
[0150]
为此，本技术实施例还公开了一种药物组合物，其包括上述实施例提供的抗体以及药学上可接受的辅料或载体。
[0151]
术语“药学上可接受的”意指经有关管理机构批准或公认药典中所列用于动物，更特别地用于人的。术语“载体”是指与试剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，弗氏完全和不完全佐剂)、赋形剂或媒介物。这样的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，包括例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物和/或诊断组合物时，水是常用载体。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可被用作液体载体，特别是用于可注射溶液。适当的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、无水脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。药学上可接受的载体、赋形剂和稳定剂的另外实例包括但不限于缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐以及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白和明胶；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,精氨酸或赖氨酸；单糖,二糖以及其它糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如edta；糖醇例如甘露醇或山梨醇；形成盐的抗衡离子例如钠；和/或非离子型表面活性剂例如tweentm、聚乙二醇(peg)和pluronicstm，如本领域中已知的。除了上述成分外，本发明的药物和/或诊断组合物还可包括润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、持续释放制剂等形式。
[0152]
综上所述，本技术中涉及一种stat3蛋白tyr705磷酸化抗原肽及应用，利用所述抗原肽制备的抗体可以识别δs701及fl亚型tyr705位点的磷酸化水平，本技术中提供的所述抗体的制备方法，操作简单，通过此方法制得的抗体特异性强、纯度高、稳定性好。
[0153]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。