脐带间充质干细胞培养方法与流程

1.本技术涉及生物领域，具体的涉及脐带间充质干细胞培养方法。技术领域
[0002][0003]
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)最早起源于早期中胚层，能够自我更新并具有多向分化的潜能，可从成体骨髓、牙髓、脂肪组织、脐带等组织中分离。由于mscs具有免疫调节的作用，因此mscs在损伤组织修复和自身免疫性疾病的细胞治疗领域备受青睐。其中，来源于脐带的间充质干细胞(hucmscs)因具有多能性、低致瘤性、低免疫原性、增殖率高和获取方便等特点，成为了同种异体环境中细胞移植的重要适用细胞来源，其亦可能成为干细胞治疗的优先选择。人脐带间充质干细胞(hucmscs)的来源大致可以分为4种:(1)从人脐带华通胶中得到的间充质干细胞，(2)来源于人脐带血的间充质干细胞(hucmscs)，(3)来自人脐带血管周围组织的间充质干细胞(hucpv-mscs)，(4)从羊膜中获得的间充质干细胞(hamscs)。
[0004]
人类间充质干细胞在各种动物模型中已经被证明了可以发挥抗炎免疫调节和修复的作用。在大多数调查中发现骨髓是间充质干细胞的主要来源，但是在骨髓中收集间充质干细胞是有侵害的，并且间充质干细胞的数量髓年龄增长而减少，这就明显限制了间充质干细胞的在临床的应用。在2004年，有研究证明人脐带血有丰富的间充质干细胞，并能够诱导分化其表面标记，且类似于从各种组织中提取的间充质干细胞，例如骨髓。因此，脐带血来源的间充质干细胞已被广泛适用于各种实验模型。最近研究的焦点是脐带血间充质干细胞和癌症转移之间的关系。脐带血间充质干细胞是有吸引力的癌症靶向治疗工具，人脐带血间充质干细胞具有迁移到肿瘤的能力，它们可作为肿瘤治疗的靶向载体。目前已经有几例报告证实了间充质干细胞对癌症的疗效。研究脐带血间充质干细胞与乳腺癌干细胞在体内及体外的关系，实验中cck-8的结果测定了软琼脂集落的形成实验，表明人脐带血间充质干细胞可以抑制人乳腺癌细胞的生长。他们推测脐带血间充质干细胞可能通过阻断pi3k/akt信号通路来抑制pi3k和akt蛋白激酶的活性从而来抑制肿瘤细胞增殖。也有实验中发现脐带血间充质干细胞可以抑制原发性多形性胶质母细胞瘤的生长并引起肿瘤细胞凋亡。脐带血间充质干细胞促进原发性多形性胶质母细胞瘤的细胞凋亡是通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体造成的。脐带血间充质干细胞还可以通过分泌dkk1从而调控wnt信号通路来抑制乳腺癌细胞mda-mb-231细胞增殖。间充质干细胞是一种很有前途的治疗工具，能为肿瘤的治疗提供药物，研究中，被慢病毒转染脐带血间充质干细胞可以载体编码被甲胎蛋白启动子驱动的可溶性人类肿瘤坏死因子及相关凋亡诱导配体基因，可用来研究这些细胞对小鼠原位移植肝癌的治疗作用。他们的研究表明脐带血间充质干细胞可以有效的被慢病毒转染，并可以迁移到体内及体外的肝癌组织中，在通过静脉注射干细胞后，这些相关凋亡诱导配体在肿瘤部位得以表达，并表现出显著的抗肿瘤活性，当联合5-fu共同使用时，这种效果将会更强。也有研究表明脐带血间充质干细胞与食管癌细胞人工融合可抑制食管癌细胞生长、增加细胞凋亡、抑制肿瘤的发生。然而，也有证据证实了脐带血间充质干细胞
和癌细胞之间相互作用会促使肿瘤细胞转移的危险性。间充质干细胞促进了乳腺癌的转移。间充质干细胞分泌的趋化因子配体5及癌细胞表达的趋化因子受体5相互作用在间充质干细胞调节肿瘤转移的过程中发挥了重要作用。随后，间充质干细胞通过分泌细胞衍生因子-1、白细胞介素6和血管内皮生长因子来促进癌细胞转移。肿瘤的侵袭和迁移是肿瘤转移的两个步骤，为了知道脐带血间充质干细胞是否能够在体外影响肿瘤细胞侵袭，在实验中对乳腺癌细胞的迁移与脐带血间充质干细胞之间有无关系进行了测试，当transwell下室中没有脐带血间充质干细胞时，乳腺癌细胞在每个小室中迁移和侵袭的数目是较少的，然而，在有脐带血间充质干细胞的实验组则数目明显升高，这个结果表明体外实验中脐带血间充质干细胞促进了乳腺癌细胞的迁移，这是由于细胞分泌的趋化因子造成的。同时它们排除了脐带血间充质干细胞会使乳腺癌细胞增殖，从而干扰乳腺癌细胞侵袭迁移的可能性。此外有研究表明间充质干细胞进入肿瘤组织后可分化为成纤维母细胞，进而分化为肌纤维母细胞，在肿瘤生长、浸润与转移中起重要作用。
[0005]
一氧化氮合酶(nos)是催化一氧化氮(no)生物合成的酶，是内源性no合成的限速酶，自1987年证实血管内皮细胞舒张因子(edrf)的化学本质就是no以来，no便成为现代生物学研究中十分活跃的领域。nos含量的变化必将伴随着no合成的改变。已知enos和inos是nos的两类同工酶，它们在体内发挥着不同的作用，inos也叫诱导型一氧化氮合酶(缩写inos或nos2)。有关nos在体内其它部位肿瘤组织中表达的研究报道很多。例如:人肝癌、食管癌、结肠腺癌、膀胱癌及前列腺等的肿瘤中发现nos活性增高。但是，有关系统地研究nos在宫颈癌组织中表达的研究报道却很少。已有的结果表明：enos、inos(nos的两类同工酶)在宫颈癌中的阳性表达率明显高于其对照组织，这说明enos、inos的表达与宫颈癌的发生、发展有关。enos、inos在正常宫颈组织中的弱表达，表明由它们催化生成的较少量no，可能参与了正常宫颈上皮的保护及分泌等生理功能，这与梅祖敏等的研究结果一致。enos、inos在宫颈癌组织中的异常表达，表明了宫颈癌局部组织中由两种nos催化诱导合成的no量较多，这些高水平的no可能非但不能发挥抗肿瘤活性，反而促进了宫颈癌细胞的增殖与分化，从而促进了肿瘤细胞的生长，发挥了致瘤和促瘤生长作用。利用nos在宫颈组织中的表达特点，将nos作为将来早期诊断宫颈癌的检测指标之一，也可以利用nos抑制剂来治疗宫颈癌。
[0006]
但是目前，针对nos的抑制剂研究在国内不是很多，提供的抑制剂的种类也不够丰富，针对nos抑制剂与其他药物特别是脐带血间充质干细胞一起联用的研究也不是很多。


技术实现要素：

[0007]
本发明针对现有技术的缺陷，提供了一种改进的脐带血间充质干细胞的分离和培养方法。
[0008]
具体的，本发明提供一种脐带血间充质干细胞分离和培养方法，具体的，将婴儿脐带血采集后用ficoll细胞分离液密度梯度离心后获得单个核细胞，ficoll分离液与脐带血的体积比为1:1-1:3，分离后的细胞用imdm基础培养基离心洗涤若干次，调整细胞密度备用；将分离得到的脐血单个核细胞接种到6孔板中，加入含10％fbs+il-3(15μg/l)+gm-csf(5μg/l)+g-csf(5μg/l)的imdm培养基，置37℃，5％co2的饱和湿度培养箱中，3天后进行半量换液，去除未贴壁细胞.以后每3天半量换液1次，培养获得细胞即为脐带血间充质干细胞。
[0009]
进一步的，本发明还提供了特异性针对nos2的单克隆抗体。
[0010]
具体的，nos2的单克隆抗体为1a20，经可变区序列鉴定，获知其轻链可变区序列如seq id no：1所示，其重链可变区序列如seq id no：2所示。
[0011]
进一步的，本发明的单克隆抗体还可以进行适当的保守氨基酸取代，所述取代后的抗体仍然保持相应的活性。
[0012]
另外，关于本发明的单克隆抗体，改变后的氨基酸数量优选为20个氨基酸以内，更优选为10个氨基酸以内，更优选为5个氨基酸以内(例如，3个氨基酸以内，1个氨基酸)，即，在本说明书中，所谓“多个氨基酸”，优选为20个以下的氨基酸，更优选为10个以下的氨基酸，更优选为5个以下，更优选为2个以下。例如，在酸性氨基酸(天冬氨酸及谷氨酸)，碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，中性氨基酸中，具有烃链的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)，具有羟基的氨基酸(丝氨酸、特氨酸)，含有硫磺的氨基酸(半胱氨酸、甲氨酸)。
[0013]
进一步的，本发明的单克隆抗体可以在轻链可变区序列seq id no：1基础上保持99％的序列同一性的修饰、在重链可变区序列seq id no：2基础上保持99％的序列同一性的修饰的单克隆抗体，并且仍保持抗体活性。
[0014]
本发明还提供了一种药物组合物，该组合物含有药学上有效量的本发明单抗以及药学上可接受的载体。
[0015]
本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
[0016]
本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的突变蛋白相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
[0017]
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。
[0018]
进一步的，本发明还提供了nos2的单克隆抗体在制备用于治疗宫颈癌的药物组合物中的用途。
[0019]
进一步的，本发明还提供了nos2的单克隆抗体和脐带血间充质干细胞在制备治疗宫颈癌的药物组合物中的用途，其中，nos2的单克隆抗体能够宫颈癌细胞对脐带血间充质干细胞的治疗敏感性。
[0020]
本发明目的至少在于提供一种高度稳定的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含抗体，并至少包含缓冲液、等渗调节剂、稳定剂和/或表面活性剂中的一种或几种。特别地，所述药物组合物包含1-150mg/ml抗nos2单克隆抗体(单抗)、3-50mm缓冲液、2-150mg/ml等渗调节剂/稳定剂和0.01-0.8mg/ml表面活性剂，且ph为约4.5-6.8。该制剂能阻止其中抗体的聚合物增长，同时，能长时间较好的维持抗体的生物结合活性。
[0021]
在一些方案中，所述缓冲液选自枸橼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、组氨酸盐缓冲液
或磷酸盐缓冲液；优选枸橼酸盐缓冲液或组氨酸盐缓冲液；更优选组氨酸盐缓冲液。在一些方案中，所述缓冲液浓度约为4.5-50mm，优选约为5-25mm，更优选约为10-20mm，最优选约为10-15mm。
[0022]
在一些方案中，所述缓冲液为组氨酸盐缓冲液。所述组氨酸盐缓冲液浓度约为5-30mm，优选约为10-25mm，更优选为约为10-20mm，最优选约为10-15mm。在一些具体方案中，所述组氨酸盐缓冲液约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm或约30mm。在一些实施方案中，所述组氨酸盐缓冲液约10mm。在另一些实施方案中，所述组氨酸盐缓冲液约15mm。在另一些实施方案中，所述组氨酸盐缓冲液约20mm。其中，所述组氨酸盐缓冲液包含组氨酸和盐酸。
[0023]
在一些方案中，所述缓冲液为醋酸盐缓冲液。所述醋酸盐缓冲液浓度约为5-30mm，优选约为10-25mm，更优选约为10-20mm，最优选约为10-15mm。其中，所述醋酸盐缓冲液包含醋酸盐和醋酸。本发明所述的“醋酸盐”包括醋酸的药学上可接受的各种无机酸盐或有机酸盐或其水合物，包括但不限于醋酸钾或其水合物、醋酸钠或其水合物；优选地，所述醋酸盐为醋酸钠或三水合醋酸钠。
[0024]
在一些方案中，所述缓冲液为枸橼酸盐缓冲液。所述枸橼酸盐缓冲液浓度约为3-30mm，优选约为4.5-30mm，更优选约为5-20mm，最优选约为5-10mm。在一些具体方案中，所述枸橼酸盐缓冲液约5mm、约10mm、约15mm、约20mm或约25mm。在一些实施方案中，所述枸橼酸盐缓冲液约5mm。在另一些实施方案中，所述枸橼酸盐缓冲液约10mm。在另一些实施方案中，所述枸橼酸盐缓冲液约15mm。本发明所述的“枸橼酸”包括枸橼酸本身以及枸橼酸的水合物，例如一水合枸橼酸；所述“枸橼酸盐”包括枸橼酸的药学上可接受的各种无机酸盐或有机酸盐或其水合物，包括但不限于枸橼酸钾或其水合物、枸橼酸钠或其水合物；优选地，所述枸橼酸盐为枸橼酸钠或二水合枸橼酸钠。
[0025]
在一些方案中，等渗调节剂/稳定剂选自氯化钠、甘露醇、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、木糖醇中一种或一种以上；优选氯化钠、甘露醇和蔗糖中的一种或者一种以上；最优选蔗糖。在一些方案中，所述等渗调节剂/稳定剂的含量为约4-150mg/ml，优选为约6-120mg/ml，更优选为约40-100mg/ml，最优选为约60-80mg/ml。
[0026]
在一些方案中，以w/v计算，所述等渗调节剂/稳定剂为约20-150mg/ml的蔗糖，优选约为40-100mg/ml的蔗糖，更优选约为60-80mg/ml的蔗糖。在一些具体方案中，所述蔗糖的浓度约为40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。在一些具体实施方案中，所述蔗糖的浓度约60mg/ml。在一些具体实施方案中，所述蔗糖的浓度约70mg/ml。在一些具体实施方案中，所述蔗糖的浓度约80mg/ml。在一些具体实施方案中，所述蔗糖的浓度约90mg/ml。
[0027]
有益效果
[0028]
本发明提供了一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，另外还提供了特异性针对nos2的单克隆抗体，该抗体能够通过抑制一氧化氮合成酶的活性来治疗宫颈癌，特别是通过nos2单克隆抗体的治疗后能够显著提高宫颈癌细胞针对脐带血间充质干细胞的敏感性，二者一起能够显著的抑制宫颈癌细胞的增殖，具有显著的协同效果。
附图说明
[0029]
图1腹水抗体效价结果图
[0030]
图2单抗对一氧化氮合成酶活性的影响
[0031]
图3单克隆抗体对hela细胞存活率的影响
[0032]
图4各实验组对细胞生长的影响
具体实施方式
[0033]
本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。
[0034]
实施例1脐带血间充质干细胞的分离及培养
[0035]
婴儿脐带血采集后用密度为1.077g/ml的ficoll细胞分离液以2500r/min，30min密度梯度离心后获得单个核细胞，ficoll分离液与脐带血的体积比为1:2，分离后的细胞用imdm基础培养基离心洗涤3次(1200r/min，3min)，调整细胞密度备用；将分离得到的脐血单个核细胞以2x106个/ml密度接种到6孔板中，加入含10％fbs+il-3(15μg/l)+gm-csf(5μg/l)+g-csf(5μg/l)的imdm培养基，置37℃，5％co2的饱和湿度培养箱中，3天后进行半量换液，去除未贴壁细胞.以后每3天半量换液1次，待细胞融合达85％，用0.125％胰酶+0.02％edta消化，按1:2的比例传代，传至第三代(p3)时将细胞消化，收集细胞即为脐带血间充质干细胞，并进行流式检测。其方法为：收集脐带血间充质干细胞，调整细胞浓度为107个/ml，加入5μl荧光标记抗体cd13-pe、cd29-fitc、cd44-fitc、cd166-pe、cd34-fitc、cd34-fitc、cd45-fitc、cd105-fitc、hla-dr-pe，于冰上孵育细胞30min，用pbs洗涤2次，1000r/min离心6min，用500μl的pbs重悬细胞，使细胞浓度在106个/ml左右，然后流式上机分析。结果显示，cd13、cd29、cd105、cd166和cd44呈阳性表达，而cd34、cd45和hla-dr呈阴性表达，说明培养获得的细胞即为脐带血间充质干细胞。
[0036]
实施例2nos2单克隆抗体的制备
[0037]
以重组表达的nos2蛋白为免疫原(hzbscience，货号：zy837hu011)，与5倍稀释的montanide
tm
gel01st聚合物佐剂等体积混合，经皮下多点注射免疫balb/c小鼠，共免疫3次，每次免疫间隔2周，剂量为100μg/只。三免后7d用不加佐剂的nos2蛋白冲击免疫，6d后取效价最高的2号小鼠脾细胞进行融合。
[0038]
将sp2/0细胞与脾细胞在peg1500作用下融合，融合后使用dmem培养基加入hat及ht进行换液。待杂交瘤细胞生长至底面积1/3左右，吸取上清液，用间接elisa方法测定其抗体效价。选择测定为强阳性的孔进行亚克隆筛选，获得二株效价最高的抗nos2蛋白的杂交瘤细胞株，命名为1a20和5g23。
[0039]
将balb/c小鼠进行腹腔石蜡致敏，7d后分别注射分离的二个杂交瘤细胞制备腹水。将制备出的腹水单克隆抗体利用间接elisa方法测定抗体效价，用2μg重组nos2蛋白作为包被抗原，封闭后将腹水单克隆抗体从1:10开始连续稀释测定抗体效价。结果如图1所示。
[0040]
从图1的结果可以看出，二株单抗的效价均大于了1:512000，具有较好的效价效果。
[0041]
利用硫酸铵盐析法对制备的腹水进行粗提，再使用proteing亲和层析柱进一步纯化得到纯度较高的igg抗体，并将纯化的单克隆抗体进行sds-page鉴定结果显示，单克隆抗体1a20和5g23均在约25kd和56kd出现明显两条带，即为单克隆抗体轻链和重链，证明得到了较纯单克隆抗体。
[0042]
使用小鼠ig类/单抗亚类检测试剂盒，将上述制备的腹水进行单克隆抗体亚型鉴定。1a20和5g23单克隆抗体的类型均为igg1型，轻链均为κ链。
[0043]
实施例3nos2单克隆抗体1a20单抗亲和力的测定
[0044]
应用间接elisa法，以1μg/ml的浓度用nos2重组蛋白包被酶标板，封闭后加入倍比稀释的纯化单抗进行孵育，以hrp标记的山羊抗小鼠igg为二抗，酶标仪读取od450nm吸光值。连续几个稀释度的od450nm读数不再增大时视为抗原抗体100％结合，以抗体浓度(mol/l)为横坐标，od450nm吸光值为纵坐标做散点图，以读数最大值一半时抗原抗体结合率为50％，生成对数趋势线和公式。将od450nm最大值的一半代入公式，求出此时的抗体浓度即为亲和力解离常数(kd)。结果显示，1a20单抗的kd值为12.53nm。
[0045]
实施例4nos2单克隆抗体1a20单抗活性鉴定
[0046]
将hela细胞株接种到96孔板内，保持每孔内相同的细胞数，当细胞生长到80％时，分设阴性对照组、阳性对照组1400w组(浓度为50μg/l)，单抗组(浓度分别是1，10，50，100μg/ml)每组设6个复孔培养。培养6h后按照一氧化氮合成酶检测试剂盒说明书检测其活性，以没有细胞的孔为空白对照，激发波长为495nm，发射波长为515nm，取该96孔板用荧光酶标仪检测，并计算相对活性。结果如图2所示。
[0047]
从图2的结果可以看出，1400w和本发明的1a20抗体均能显著抑制一氧化氮合成酶的活性，相对于阴性组，差异均较为显著p《0.05。同时本发明1a20的抗体组具有浓度依赖性的抑制浓度一氧化氮合成酶的活性，在1a20单抗的浓度为50μg/ml时，活性相对于阴性对照组为(0.30
±
0.04)，具有较好的活性抑制效果，抑制效果也远远好于阳性对照组。
[0048]
实施例5nos2单克隆抗体1a20单抗对hela细胞活性的影响
[0049]
按照密度5
×
104/ml将hela细胞接种于96孔板。设对照组和不同浓度药物组:阳性对照1400w组(50μg/ml)、单抗用药组(浓度分别是1，10，50，100μg/ml)。在培养48h后，每孔加入10μlmtt(5mg/ml)继续孵育4h，每孔加入100μldmso，低速振荡10min，用酶联免疫检测仪测量490nm处各孔的吸光度。以对照组细胞活力为100％，按公式:细胞抑制率＝1
–
(药物组吸光度/对照组吸光度)
×
100％，计算各组细胞存活率。结果如图3所示。
[0050]
从图3结果显示，单独使用1400w和低浓度的单抗对细胞增殖的抑制作用不明显。在50μg/ml浓度的单抗条件下，细胞的存活率为(70.2
±
1.8)％，这说明本发明的单抗具有一定的抑制癌细胞存活率的效果。
[0051]
实施例6nos2单克隆抗体1a20单抗联合脐带血间充质干细胞对hela细胞活性的影响
[0052]
取对数期生长状态良好的hela细胞，铺设到96孔板中，每孔接种10000个。实验分组如下：
[0053]
对照组：不加处理，只有hela细胞；
[0054]
干细胞共培养组：将3.0μm孔径的transwell小室放入96孔培养板，每孔接种2万个对数期生长状态良好的实施例1分离的干细胞；
[0055]
干细胞联合单抗共培养组：将3.0μm孔径的transwell小室放入96孔培养板，每孔接种2万个对数期生长状态良好的实施例1分离的干细胞，同时添加100μg/ml的1a20单抗；
[0056]
单抗共培养组：添加100μg/ml的1a20单抗；
[0057]
干细胞联合阳性对照共培养组：将3.0μm孔径的transwell小室放入96孔培养板，每孔接种2万个对数期生长状态良好的实施例1分离的干细胞，同时添加100μg/ml的1400w(inos抑制剂)；
[0058]
空白对照组每孔加入dmem完全培养基补足体系。
[0059]
每组设3个重复，培养3d后细胞进行消化。消化后加入100μl基础培养基和10μlcck-8染色溶液，混合均匀并置于恒温培养箱中孵育。孵育2h后吸取100μl上清液于新的96孔板中，置于酶标仪内测定波长450nm处d值。
[0060]
从图4的结果可以看出，单独使用单抗或者干细胞共培养组也能够抑制细胞增殖，减少细胞的od值，但是效果没有采用单抗和干细胞联合使用后的效果明显，干细胞和单抗共培养组hela细胞的d值极显著低于对照组(p《0.01)，其结果只有0.13
±
0.02，比干细胞联合阳性对照组的0.24
±
0.02的效果也要显著。
[0061]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。