检测木瓜秀粉蚧LGMN基因转录水平的引物及方法

本发明涉及检测木瓜秀粉蚧lgmn基因转录水平的引物及方法，属于生物。

背景技术：

1、木瓜秀粉蚧隶属于半翅目，蚧总科，粉蚧科秀粉蚧属。其寄主范围广泛，是一种扩散性强、生命力强、繁殖力强的重要潜在经济害虫。该虫一般被认为原产于墨西哥或中美洲地区，1955年在墨西哥采集到木瓜秀粉蚧第一批标本。木瓜秀粉蚧喜生活在叶片的叶脉处、茎叶的生长点、花叶凹凸或重合处、果实表面的凹陷或沟缝等隐蔽的部位。主要以若虫和雌成虫刺吸寄主植物的茎干、叶、花和果实等器官组织的汁液，导致叶片卷缩畸形、玫瑰花结、失绿黄化、枯萎脱落等；亦会导致枝条干枯、植株矮小或滞育、果实弱小或畸形、落花落果，危害严重时甚至导致整棵植株死亡。自1995年在圣马丁报道木瓜秀粉蚧危害之后，现已扩散至中美洲、北美洲、太平洋、非洲、亚洲等地区至少40个国家或地区，给番木瓜产业造成严重损失。木瓜秀粉蚧现也已侵入中国境内，给我国的番木瓜和花卉业带来巨大的潜在威胁。

2、关于木瓜秀粉蚧的研究，主要侧重于对其形态特征、生化机理及药剂防治等。陈青等(2018)测定了在不同温度培育条件下木瓜秀粉蚧体内酶的活性差异，结果发现高温和低温均能诱导木瓜秀粉蚧保护酶活性的提高。王亚茹等(2018)发现取食木薯的木瓜秀粉蚧体内的保护酶的活性显著降低，取食能力也降低。陈谦等（2020）研究发现木瓜秀粉蚧取食一些木薯品种后能够抑制体内抗氧化酶活性。关于不同寄主饲养的木瓜秀粉蚧lgmn基因表达特性的研究，国内外未见报道。

3、lgmn编码一种天冬氨酸内肽酶(asparaginyl endopeptidase，aep)，具有半胱氨酸蛋白酶活性，能够特异性结合天冬酰胺，与部分神经系统疾病有密切的关联。lgmn在抗原递呈细胞、树突状细胞和b细胞中均有较高的表达量。lgmn是与应激和免疫相关的基因，对于细胞的增殖分化有直接作用。hinkelbein 等（2015）将大鼠置于高氧的环境下一定时间后，发现 lgmn蛋白的表达下调。anders 等（2011）发现lgmn基因能特异性地抑制与自噬相关酶bhmt的裂解失活。morito 等（2007）研究发现lgmn在小鼠小管细胞中高度表达，进而发现lgmn蛋白在体外可以直接降解细胞外基质主要成分之一的纤连蛋白。shirahama-noda等（2003）发现lgmn在溶酶体的降解系统中起着关键作用。在lgmn蛋白的参与下纤连蛋白的降解发生在溶酶体上，据此推测lgmn可能在通过降解近端小管细胞外纤连蛋白从而对细胞外基质进行重构的过程中起重要作用。大量研究已经证明了lgmn与细胞的增殖分化相关，抑制自噬相关酶的裂解失活，在体外更是能直接降解纤连蛋白，说明lgmn能够促进细胞的自噬活动。

4、关于木瓜秀粉蚧lgmn基因的表达等研究国内外未见报道，因此采用实时荧光定量pcr研究不同寄主处理下木瓜秀粉蚧lgmn基因的表达特性，结果表明，不同的寄主，lgmn基因的表达量也不同，并与转录组表达量的变化趋势一致，说明寄主转换可以影响lgmn基因的表达调控。若将一些目标基因作为害虫控制的靶标，可以开辟害虫分子调控的新领域，为农业害虫的防治提供新的方法和思路。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供检测木瓜秀粉蚧lgmn基因转录水平的引物及方法，为全面了解木瓜秀粉蚧lgmn基因的转录水平而设计的不同寄主处理。

2、为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、将取食木瓜和土豆两种不同寄主的木瓜秀粉蚧分别采20只到eppendorf管中，分为3个生物学重复，共6组样品。

4、设计一对检测木瓜秀粉蚧lgmn基因转录水平的引物，包括符合荧光定量pcr反应特点的上下游引物：

5、lgmn-f：5`- gctaccatatcctccaccac-3`，

6、lgmn-r：5`- ttttctcttcagcattcaac-3`；

7、以及内参基因tubulin的上下游引物：

8、tubulin-f: 5`-cttcacttcttcatgcctgg-3`

9、tubulin-r: 5`-tttgttcgtcaacttctttc-3`。

10、本发明所述检测木瓜秀粉蚧lgmn基因转录水平的荧光定量pcr方法，按如下步骤进行：

11、（1）cdna第一链合成：提取样本的总rna并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的rna为模板反转录得到的cdna；

12、（2）对下述引物进行常规pcr检测：

13、木瓜秀粉蚧lgmn基因的荧光定量上下游引物：

14、lgmn-f：5`- gctaccatatcctccaccac-3`，

15、lgmn-r：5`- ttttctcttcagcattcaac-3`；

16、内参基因tubulin的上下游引物：

17、tubulin-f: 5`-cttcacttcttcatgcctgg-3`，

18、tubulin-r: 5`-tttgttcgtcaacttctttc-3`；

19、常规pcr扩增体系总体积为20µl：2x taq plus master mix 10µl，上游引物0.8µl(5um)，下游引物0.8µl (5um)，100ng/µl cdna模板1.0µl，水7.4µl；

20、常规pcr反应程序为：94℃预变性5 min，然后95℃变性30 s， 50℃退火30 s， 72℃延伸1 min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；

21、（3）实时荧光定量pcr反应：

22、以步骤（1）得到的cdna为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量pcr反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值。

23、实时荧光定量pcr扩增体系为：2x chamq sybr color qpcr master mix 10µl，上游引物0.8µl (5um)，下游引物0.8µl (5um)，50 x rox reference dye 2 0.4µl，100 ng/µl cdna 2.0µl，补足水至20µl；

24、实时荧光定量pcr反应程序为：95℃预变性5 min，然后95℃变性5 s 、50℃退火30s，72℃延伸40 s，40个循环。

25、本发明更加详细的试验方法如下：

26、木瓜秀粉蚧lgmn基因的实时荧光定量pcr检测方法可通过以下步骤实现：

27、（1）引物设计：根据转录组测序结果得到的木瓜秀粉蚧lgmn基因的序列，使用dnaman软件设计适合荧光定量pcr检测的特异性引物，引物序列如下：

28、lgmn-f：5`- gctaccatatcctccaccac-3`，

29、lgmn-r：5`- ttttctcttcagcattcaac-3`。

30、同时，根据转录组测序结果得到的木瓜秀粉蚧tubulin基因的序列，设计用于荧光定量pcr内对照物的引物，引物序列如下：

31、tubulin-f: 5`-cttcacttcttcatgcctgg-3`

32、tubulin-r: 5`-tttgttcgtcaacttctttc-3`

33、（2）木瓜秀粉蚧处理试验：在人工气候箱里分别培育木瓜苗和土豆苗，用于饲养木瓜秀粉蚧，各采20只到eppendorf管中，分为3个生物学重复，共6组样品。虫样处理后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。

34、（3）cdna第一链合成：参照全式金公司的 transzoltm up plus rna kit试剂盒说明书提取总rna，按照诺唯赞公司的 hiscript q rt supermix for qpcr (+gdna wiper)试剂盒说明书，合成cdna第一链。

35、（4）实时荧光定量pcr反应：实时荧光定量pcr采用南京诺唯赞生物科技有限公司的chamq sybr color qpcr master mix (2x)试剂盒进行。以上述合成的cdna第一链为模板，上述lgmn-f、lgmn-r和tubulin-f、tubulin-r为特异性引物，进行荧光定量pcr程序，每个样品设3个平行重复，扩增后取所得平行ct值的平均数。

36、实时荧光定量pcr扩增体系为：2x chamq sybr color qpcr master mix 10µl，上游引物0.8µl (5um)，下游引物0.8µl (5um)，50 x rox reference dye 2 0.4µl，100 ng/µl cdna 2.0µl，补足水至20µl；

37、实时荧光定量pcr反应程序为：95℃预变性5 min，然后95℃变性5 s 、50℃退火30s，72℃延伸40 s，40个循环。

38、（5）木瓜秀粉蚧lgmn基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为：相对mrna表达= 2-δδct×100%，其中ct值=靶基因ct值- tubulin ct值。

39、（6）图3为木瓜秀粉蚧取食不同寄主后lgmn基因的差异表达。结果表明，因寄主不同，lgmn基因的表达量也不同，并与转录组的表达量变化趋势一致，这为我们深入开展木瓜秀粉蚧lgmn基因的研究提供了重要的基础数据。

40、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

41、（1）本发明中的不同寄主处理措施，对昆虫绝大部分lgmn基因都适用，这对全面深入研究基因表达特性具有重要的意义。

42、（2）本发明所述高效快捷的荧光定量pcr法，包括荧光定量pcr程序等，实际用时50min，相对于现有技术大大缩短了反应时间，具有高效快捷的特性。

43、（3）本发明所述的荧光定量pcr法，提供常规pcr电泳结果图，可以直观快捷的反映出引物的特异性。