一种系统性红斑狼疮的外周血TCR标志物序列及其检测试剂盒和应用的制作方法

本发明属于基因工程，尤其涉及一种系统性红斑狼疮的外周血tcr标志物及其检测试剂盒和应用。

背景技术：

1、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,sle)是一种可造成多系统损害的自身免疫性疾病。其确切的发病原因尚不明确，但很多研究显示遗传、内分泌、感染、免疫异常和一些环境因素都与sle的发病有关。在多种发病相关因素相互作用下，导致t淋巴细胞减少、调节性t细胞抑制功能降低、b细胞过度增生，产生大量的自身抗体，并与体内相应的自身抗原结合形成相应的免疫复合物，沉积在皮肤、关节、小血管、肾小球等部位。

2、在补体的参与下，引起急慢性炎症及组织坏死(如狼疮肾炎)，或抗体直接与组织细胞抗原作用，引起细胞破坏(如红细胞、淋巴细胞及血小板壁的特异性抗原与相应的自身抗体结合，分别引起溶血性贫血、淋巴细胞减少症和血小板减少症)，从而导致机体的多系统损害。

3、1、sle的临床症状

4、sle在早期可仅有1个脏器受累的表现，也可相继出现几个脏器受损的表现。最常见的早期症状为发热、疲劳、体重减轻、关节炎(痛)等，较常见的早期表现为皮肤损害、多发性浆膜炎、肾脏病变、中枢神经系统损害、血液异常及消化道症状等。此时实验室检验可发现自身抗体(尤其是抗核抗体，anti-nuclear antibody,ana)阳性。但因sle的临床表现变化无常，起病方式多变，所以容易错失早期诊断和治疗的机会。

5、1)发热：

6、85％以上的病人于病程中可有不同程度发热，有的可长期持续发热而无其他症状及明显的实验室发现，但多伴有ana阳性。

7、2)关节肌肉症状：

8、90％以上的病人有关节痛，常为先发症状。约半数病人于病情恶化期可出现肌痛和肌无力。

9、3)皮肤损害：

10、80％的病例可出现皮肤损害，以皮疹为最常见，亦是sle的特征性表现。典型皮损为发生在面部的蝶形红斑，对称性分布于双侧面颊和鼻梁。四肢皮疹也有很大的特异性，常在指(趾)尖出现特征性红斑性肿胀和毛细血管扩张。20％～30％的病人对日光过敏。脱发和黏膜溃疡为sle常见的皮损，多发生于病情活动期。

11、4)血液学：

12、几乎所有病人在病程中都可出现血液学改变，其中以贫血为最常见。约10％病人可出现自身免疫性溶血性贫血，常伴有脾大，以致被误诊为脾功能亢进。sle病人输血反应的发生率高，且反应程度也较严重，往往造成不可逆转性病情恶化甚至死亡。白细胞减少也是常见的血液学表现，中性粒细胞和淋巴细胞都减少。约15％病例有血小板减少，可为早期表现，引起严重的出血。还有表现为血小板凝聚异常，常引起皮肤紫癜。

13、5)肾脏病变：

14、最为常见。对sle病人进行常规肾活检显示，几乎都有肾损害，但仅半数病例有临床症状。狼疮肾脏病变主要为肾炎和肾病综合征。肾功能早期正常，随着病程延长，肾功能亦逐渐恶化，晚期可出现尿毒症，是sle的死亡原因之一。

15、6)心血管系统症状：

16、心脏损害见于2/3以上的病人，包括心包炎、心肌炎和心内膜炎等，其中以心包炎为最常见。2％～8％病人有冠状动脉病变，常表现为心绞痛、心肌损害及心力衰竭等。狼疮性心内膜炎常造成心瓣膜病变，临床上极易误诊为风湿性心脏病，但数月或数年后心衰症状更加恶化，甚至导致死亡。

17、7)呼吸系统：

18、见于50％～70％的病人，胸膜、肺实质和肺血管均可受累，其中以胸膜炎为最常见。最常见的肺功能障碍为气体弥散功能下降，肺活量下降。sle肺炎最严重的症状为持续性肺泡型浸润，起病急骤，临床表现为重度呼吸困难、呼吸过速、缺氧、发绀，此种肺部病变的病死率极高。

19、8)消化系统：

20、可发生于半数以上的病例，表现为腹痛，尤以狼疮危象为明显，常误诊为急腹症。

21、9)神经系统症状：

22、约见于50％以上的病人，常累及中枢神经系统，可出现各种形式的神经病和精神病。精神、神经系统症状可以是首发症状，但更常见于病程中或晚期，有人称此为狼疮脑病或神经精神型红斑狼疮。

23、①癫痫：为常见的中枢神经病变之一，发生率为15％，儿童患者更高。

24、②头痛：约占10％，与病情活动有关。

25、③中枢神经系统血管病变：约见于15％的病人，其中以偏瘫失语者略多。

26、④周围神经病变：表现为各种感觉和运动障碍，尤以下肢明显的感觉运动障碍。

27、⑤多动症：表现为舞蹈症，常为首发症状，可反复发作。

28、⑥颅内高压症或无菌性脑膜炎：前者表现为剧烈头痛、呕吐，后者表现为头痛、呕吐、脑膜刺激征。

29、⑦精神失常：常见于大多数病例，可以是sle的首发症状，但多数在病情加剧时才出现。最常见的精神症状是抑郁状态。另一种常见的精神障碍是精神分裂症样表现，可能与脑血管炎、脑器质性损害有关。

30、10)五官症状：多表现有眼部症状，以眼底改变为主。

31、11)淋巴结：sle常有不同程度的淋巴结肿大。

32、12)狼疮危象：系sle的一种恶化表现。其表现为高热，全身极度衰竭和疲乏，严重头痛和腹痛，常有胸痛。还可有各系统的严重损害如心肌炎、心力衰竭和中枢神经系统症状，表现为癫痫发作、精神病和昏迷，伴发局部感染或败血症等。如肾脏受累，肾功衰竭可导致死亡。

33、sle的临床表现变化无常，并常与其他风湿病重叠，还可能与其他非结缔组织病性自身免疫病重叠，如甲状腺炎、甲状腺功能亢进症、肾上腺炎、恶性贫血、血栓性血小板减少性紫癜、慢性胃炎等。

34、2、现有检查诊断sle的方法：

35、1)常规检查

36、血常规检查可发现血液系统异常，如贫血、白细胞计数减少、血小板降低等；红细胞沉降率(血沉)在sle活动期增快，而缓解期可降至正常。

37、尿液分析可发现肾脏受累，表现为蛋白尿、血尿、细胞和颗粒管型；

38、2)免疫学检查

39、50％的患者伴有低蛋白血症，疾病处于活动期时，补体水平常减低；30％的sle患者伴有高球蛋白血症，尤其是γ球蛋白升高，血清igg水平在疾病活动时升高。

40、3)生物化学检查

41、sle患者肝功能检查多为轻中度异常，较多是在病程活动时出现，伴有丙氨酸转氨酶(alt)和天门冬氨酸转氨酶(ast)等升高。部分sle患者存在严重血脂代谢紊乱，炎性指标升高，同时具有高同型半胱氨酸血症。

42、血清白蛋白异常多提示肾脏功能失代偿。发生狼疮性肾炎时，血清尿素氮及血清肌酐有助于判断临床分期和观察治疗效果。肾脏功能检查中尿液微量白蛋白定量检测，有助于判断和监测肾脏损害程度及预后。

43、4)自身抗体检测

44、目前临床开展的sle相关自身抗体常规检测项目包括：抗sm抗体(对sle特异性>90％，灵敏度20-30％)、抗dsdna抗体(对sle特异性95-100％，灵敏度30-50％)、抗磷脂抗体等。

45、5)组织病理学检查

46、皮肤狼疮带试验阳性和“满堂亮”的肾小球表现均有较高的sle特异性。

47、3、sle的诊断标准：

48、sle的诊断主要依靠临床表现、实验室检查、组织病理学和影像学检查。

49、美国风湿病协会(acr)1997年修订的sle分类标准中，明确将血液学异常、免疫学异常和自身抗体阳性等实验室检查列入了诊断标准，对于sle的诊断、鉴别诊断和判断活动性与复发都有重要的意义：

50、1)颧部红斑：遍及颧部的扁平或高出皮肤的固定性红斑，常不累及鼻唇沟部位。

51、2)盘状红斑：隆起红斑上覆有角质性鳞屑和毛囊栓塞，旧病灶可有皮肤萎缩性瘢痕。

52、3)光敏感：日光照射引起皮肤过敏。

53、4)口腔溃疡：口腔或鼻咽部无痛性溃疡。

54、5)关节炎：非侵蚀性关节炎，侵犯2个或2个以上的周围关节，特征为关节的肿、痛或有渗液。

55、6)浆膜炎：①胸膜炎：胸痛、胸膜摩擦音或胸膜渗液；②心包炎：心电图异常，心包摩擦音或心包渗液。

56、7)肾脏病变：蛋白尿>0.5g/d或+++；细胞管型可为红细胞、血红蛋白、颗粒管型或混合性管型。

57、8)神经系统异常：①抽搐：非药物性或代谢紊乱，如尿毒症、酮症酸中毒或临时性电解质紊乱所致。

58、②精神病：非上述情况所致。

59、9)血液学异常：溶血性贫血伴网织红细胞增多，白细胞减少(<4*109/l)，至少两次；淋巴细胞减少(≤1.5*109/l)至少两次；血小板减少(≤100*109/l)，除外药物影响。

60、10)免疫学异常：le细胞阳性；抗dsdna抗体阳性；sm抗体阳性；梅毒血清试验假阳性。

61、11)抗核抗体免疫荧光抗核抗体阳性或相当于该法的其他试验滴度异常，排除药物性狼疮。

62、上述11项指标具备其中4项或4项以上即可诊断为sle。

63、中华医学会风湿病学会提出的sle诊断标准：

64、1)蝶形红斑或盘状红斑。

65、2)光过敏。

66、3)口腔溃疡。

67、4)非畸形性关节炎或关节痛。

68、5)浆膜炎、胸膜炎或心包炎。

69、6)肾炎蛋白尿或管型尿或血尿。

70、7)神经系统损伤抽搐或精神症状。

71、8)血象异常白细胞<4*109/l或血小板<80*109/l或溶血性贫血。

72、9)狼疮细胞或抗dsdna抗体阳性。

73、10)抗sm抗体阳性。

74、11)抗核抗体阳性。

75、12)狼疮带试验阳性。

76、13)补体低于正常。

77、符合上述4项以上者可确诊，但应排除其他胶原病、药物性狼疮、结核病、慢性活动性肝炎等。

78、有发热、皮疹症状的应与皮肌炎、成人斯蒂尔病(aosd)、系统性血管炎、感染性疾病及肿瘤性疾病等相鉴别；以关节炎为主的症状的应与类风湿关节炎、急性风湿热等相鉴别；以肾脏受累为主症状的应与原发性肾小球疾病相鉴别。

79、另一方面，临床表现不明显，但实验室检查足以诊断为sle者，可暂称为亚临床型sle。有时可见患者具有一些症状提示sle的诊断，但不能满足4条acr的分类标准。1989年，ganczarczyk等人将这部分患者归为隐匿型狼疮，患者起始的症状和实验室检查没有显著差异，但具有sle家族史的患者均发展为sle。目前认为隐匿型狼疮是sle的一种亚型，临床表现轻微，肾脏、中枢神经系统受累极少，预后较好。

80、综上所述，sle是一种发病原因未知，全身复数器官受累，病程和症状多变的自身免疫性疾病。sle在病程早期很多症状容易与其他疾病混淆。目前已有较高特异性的实验室检验诊断方法，但现有方法的灵敏度尚不理想。因此，亟需寻找便捷、廉价且同时具有较高灵敏度和特异性的检验诊断sle的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：针对现有技术中存在的不足，提供一种利用sle患者的外周血中tcr的cdr3序列作为全新的标志物及其检测试剂盒和应用。该方法能无创且准确快速的判断待测样本是否罹患sle。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、一种系统性红斑狼疮(sle)的外周血中的tcr标志物，标志物来自tcr可变区cdr3序列，其包括如seq id no.1-100所示蛋白序列中的至少一种，如表1所示：

4、表1 sle特征性tcr标志物序列

5、

6、

7、

8、进一步地，标志物的蛋白序列为seq id no.1-100所示的序列经取代、缺失和/或替换一个或多个氨基酸后，仍具有相同功能的蛋白。

9、上述的标志物在制备检测或治疗sle的制剂中的应用。

10、进一步地，制剂包括含有该tcr标志物的t细胞受体的质粒、病毒载体或核酸片段。

11、一种用于sle检测的试剂盒，包括能与上述tcr标志物发生特异性结合的抗体。

12、一种制剂，包括能与上述tcr标志物发生特异性结合的抗体；制剂可用于对sle进行诊断、预测、检测或筛查。

13、一种检测sle的蛋白质芯片，蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的特异性抗体，特异性抗体为能与上述tcr标志物发生特异性结合的抗体。

14、本发明原理如下：

15、人体内的b淋巴细胞和t淋巴细胞是获得性免疫系统中重要的两类细胞。b细胞通过细胞表面的b细胞受体(bcr)识别抗原，后期bcr在b细胞分化成浆细胞时，表达成抗体，分泌到细胞外。t细胞通过细胞表面的t细胞受体(tcr)识别抗原。bcr和tcr的多样性是建立获得性免疫系统的基础。bcr多样性的理论值是1018，tcr多样性的理论值是1014。bcr与tcr序列中，抗原决定簇3(cdr3)是决定其抗原特异性最重要的部分，因此cdr3的序列被认为可以代表bcr、tcr序列的特性。

16、在各种疾病中，随着不同的抗原刺激，bcr和tcr的多样性或者表达水平都会发生改变。因此，利用bcr或者tcr高通量测序结果可以追踪疾病的发生、发展。人体内细胞中，衰老蛋白质降解后，其片段会被运输到细胞表面，通过组织相容性抗原ii(mchii)呈递给免疫系统中的t细胞。正常细胞呈递的抗原片段，由于免疫耐受的关系，不会引起免疫反应。一旦当正常细胞出现癌变后，突变的基因表达的异常蛋白，其片段被呈递到细胞表面后，就会引起人体免疫系统产生针对性的免疫反应。因此，分析bcr或tcr的变化，能够检测出肿瘤的发生和发展。

17、根据本发明得到的标志物，采用高通量测序分析外周血tcr序列以检测是否患有sle，具体步骤如下：

18、(1)通过高通量测序得到训练集及验证集的sle患者和对照组的外周血中的tcr序列，并分析确定每条tcr的cdr3氨基酸序列；去除cdr3序列长度小于8个氨基酸残基及大于20个氨基酸残基的tcr序列；保证每个样本的功能性tcr序列总数不低于30000；

19、(2)对每个样本的tcr序列进行随机不放回抽样，使每个样本的tcr序列数量总和均为30000；

20、(3)数据分析，确定sle特征性tcrcdr3序列：

21、a)将训练集对照组样本所有cdr3序列归总、去重，设为对照组tcr序列集；

22、b)将训练集sle患者样本所有cdr3序列归总、去重，再去除所有在对照组tcr序列集中出现过的cdr3序列，所得到的cdr3序列定义为sle特征性tcr序列集；

23、c)将sle特征性tcr序列集中，出现于两个及以上训练集sle患者样本中的cdr3序列，根据下列公式(1)计算其sle特征性权重。其中，nx为包含序列x的训练集sle患者样本数，ci为第i个包含序列x的训练集sle患者样本中序列x的重复出现次数(表达水平)。将这些序列按sle特征性权重从高到低排序，以筛选出代表性的sle特征性tcrcdr3序列。

24、

25、,(4)利用sle特征性指数判断未知受试者罹患sle风险：

26、a)训练集及验证集中对照组、sle患者和交叉验证组样本的免疫图谱，根据下列公式(2)分析其sle特征性指数。其中，ms为某个样本s中包含的属于sle特征性tcr序列集的cdr3序列的种类，cj在为第j种属于sle特征性tcr序列集的cdr3序列在该样本内的重复出现次数(表达水平)。

27、

28、b)当未知健康状况受试者的sle特征性指数高于或接近某一阈值时，此人具有较高风险罹患sle；如其sle特征指数低于该阈值，则表明其患sle风险低。

29、本发明的有益效果是：

30、1、本发明中，首先利用非sle的对照组样本和sle患者的tcr高通量测序数据建立分析模型，确定sle特征性tcr序列。通过和这些sle特征性tcr序列对比，可以清楚的判断待测样本中是否有较高sle风险者；

31、2、通过高通量测序分析tcr变化可以发现很早期的sle，根据sle特征性tcr序列分析人的免疫系统中的t细胞对sle的反应，是一种新型的检测方法；

32、3、本发明中，由于采用高通量测序技术，同时比较巨大数量的特征性tcr序列，比起单独检测一种或几种标记物，具有更高的特异性和准确性；

33、4、本发明中使用的高通量测序仪器成本低于大型影像学设备，且可向第三方外包，此外，采样、处理的人力成本低于同时检测多种标记物，也低于大量细胞学检测，因此，本发明大大降低了检测成本；

34、5、本发明只需要采取少量外周血，采样简便、安全，是一种无创检验方法；

35、6、本发明中所述sle特征性tcr序列，也可用于sle的免疫治疗。