一种选择性幽门螺旋杆菌培养基及其制备方法与流程

1.本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种选择性幽门螺旋杆菌培养基及其制备方法。


背景技术：

2.幽门螺旋杆菌是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的革兰氏阴性杆菌，2017年10月27日公布的致癌清单中再次被列为i类致癌物。
3.对幽门螺旋杆菌的诊断检测是目前本领域十分重要的研究方向，但是幽门螺旋杆菌在体外培养时，对环境要求非常苛刻，除了对气体环境有严苛的要求外，对于培养基的要求也相当严格，培养基不仅要满足幽门螺旋杆菌的营养需求，还要提供局部的微需氧条件以及合适的ph耐受范围，因而在实际工作中，培养基的质量优劣对检测结果的可靠程度有着直接的影响。
4.目前传统的分离培养基并不能适应幽门螺旋杆菌的分离培养要求，常用的培养基如哥伦比亚琼脂培养基、脑心浸液琼脂培养基在培养幽门螺旋杆菌上均没有优势，无法有效避免杂菌感染，且阳性检出率极低。
5.大多数的幽门螺旋杆菌的培养基依靠可溶性淀粉吸收毒性离子和细菌代谢产物，虽有一定的效果，但是本发明人在使用可溶性淀粉时发现，随着菌种的进一步生长，可溶性淀粉为杂菌的生长提供了良好庇护，不利于幽门螺旋杆菌的选择性培养。
6.因此，如何有效提高幽门螺旋杆菌的生长率，抑制其他干扰菌株的生长，制备一种选择性高、生长率好的培养基是需要解决的问题。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种选择性幽门螺旋杆菌培养基，以水溶性壳聚糖作为主要碳源，添加抑菌剂在不影响幽门螺旋杆菌的基础上，抑制大多数真菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长；以丙酮酸钠作为辅助提高幽门螺旋杆菌的生长和耐气性，中和氧气的毒性作用和抗生素的抑制作用，从而增强幽门螺旋杆菌的分离，同时提供一部分碳源；无菌冻融脱纤维羊血提供丰富的营养物质供幽门螺旋杆菌的生长，实现了促使幽门螺旋杆菌快速繁殖的同时，又能够避免杂菌感染。
8.为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
9.一种选择性幽门螺旋杆菌培养基，包括如下含量的成分：
[0010][0011]
进一步的，一种选择性幽门螺旋杆菌培养基，包括如下含量的成分：
[0012][0013][0014]
进一步的，所述络合壳聚糖包括壳聚糖、ca
2+
；
[0015]
具体的，所述水溶性壳聚糖的制备方法为：壳聚糖于乙酸溶液中溶解， 50～60℃下加入20％～25％(体积)h2o2解聚30～60min，再加入70％(体积)乙醇，静置沉淀，离心去上清，烘干，得到沉淀，将沉淀溶于水，加入饱和氯化钙络合，搅拌，得到水溶性壳聚糖；
[0016]
进一步的，所述水溶性壳聚糖的制备方法为：壳聚糖于乙酸溶液中溶解，50～60℃下加入20％～25％(体积)h2o2解聚至壳聚糖粘度≤100pa
·
s，再加入70％(体积)乙醇，静置沉淀，离心去上清，烘干，得到沉淀，将沉淀溶于水，20～30℃下加入饱和氯化钙络合，搅拌15min，得到水溶性壳聚糖。
[0017]
进一步的，所述抑菌剂包括但不限于万古霉素、头孢磺啶、两性霉素 b、甲氧苄啶和硫酸多粘菌素b中的至少一种。
[0018]
进一步的，所述选择性幽门螺旋杆菌培养基ph为7.0～7.5。
[0019]
本发明还提供一种选择性幽门螺旋杆菌培养基的制备方法，包括如下步骤：
[0020]
(1)混合抑菌剂溶于水中，加热灭菌或紫外照射灭菌，得到抑菌剂溶液；
[0021]
(2)取玉米淀粉溶于水中，依次加入牛心浸粉、酵母浸粉、氯化钠、胰酶消化酪蛋白胨混合，加热溶解，调整ph，灭菌；
[0022]
(3)灭菌后，加入琼脂，冷却，加入无菌冻融脱纤维羊血，冷却，再加入(1)中抑菌剂溶液，加入水溶性壳聚糖，混合均匀，得到选择性幽门螺旋杆菌培养基。
[0023]
进一步的，(3)中，所述无菌冻融脱纤维羊血的制备方法为：冻融脱纤维羊血121℃，20min灭菌后，放置到45～55℃，得到无菌冻融脱纤维羊血。
[0024]
本发明还提供上述水溶性壳聚糖作为幽门螺旋杆菌培养基中碳源和/ 或氮源的应用。
[0025]
本发明制备得到的选择性幽门螺旋杆菌培养基适用于临床、环境中幽门螺旋杆菌的检验，以及评估抗菌药物敏感性和替代药物的可能性。
[0026]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0027]
1)本发明的选择性幽门螺旋杆菌培养基，以水溶性壳聚糖为培养基的碳源、氮源，促进幽门螺旋杆菌的生长同时也减少样本中其他杂菌的生长，配合多种抑菌剂抗生素，抑制可快速生长的兼性厌氧菌和霉菌，降低非目标菌株的干扰；
[0028]
2)本发明通过添加无菌冻融脱纤维羊血、丙酮酸钠等满足幽门螺旋杆菌的生长需求，添加玉米淀粉可以吸收培养基中衍化产生的毒性氧离子，维持其生长所需的厌氧环境。
具体实施方式
[0029]
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0030]
在本发明的一些实施例中，提供了一种选择性幽门螺旋杆菌培养基，包括如下含量的成分：
[0031][0032]
上述一种选择性幽门螺旋杆菌培养基的制备方法，其步骤如下：
[0033]
(1)0.2mg万古霉素、0.5mg头孢磺啶、0.3mg两性霉素b、甲0.2mg 氧苄啶和0.1mg硫酸多粘菌素b溶于水中，121℃下保持20min灭菌或紫外照射灭菌30～60min，得到25～28mg/l的抑菌剂溶液；
[0034]
(2)取玉米淀粉溶于500ml无菌水中，按上述的配方比例，依次加入牛心浸粉、酵母浸粉、氯化钠、胰酶消化酪蛋白胨混合，加热100℃溶解，调整ph至7.2～7.5，灭菌；
[0035]
(3)灭菌后，加入琼脂，冷却至40～45℃，无菌冻融脱纤维羊血121℃，灭菌20min，冷却至40℃后加入，再加入(1)中抑菌剂溶液，冷却至室温，加入水溶性壳聚糖，混合均匀，得到选择性幽门螺旋杆菌培养基。
[0036]
优选的，(3)中，所述水溶性壳聚糖的制备方法为：壳聚糖于乙酸溶液中溶解，50～60℃下加入20％～25％(体积)h2o2解聚至壳聚糖粘度≤ 100pa
·
s，再加入70％(体积)乙醇，静置沉淀，离心去上清，烘干，得到沉淀，将沉淀溶于水，20～30℃下加入饱和氯化钙络合，搅拌15min，得到水溶性壳聚糖。
[0037]
万古霉素是一种糖肽类抗生素，用于治疗细菌感染，通过阻碍细菌细胞壁的合成，从而抑制细菌的生长和繁殖，对金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌等革兰氏阳性菌作用强；
[0038]
甲氧苄啶(tmp)为合成的广谱抗菌剂，属磺胺增效药，其抗菌作用原理为干扰细菌的叶酸代谢。对多数革兰阳性菌及革兰阴性菌有抗菌活性；
[0039]
头孢磺啶为第三代头孢菌素，是第一个抗铜绿假单胞菌的头孢类抗生素；两性霉素b为多烯类抗真菌药物，对新型隐球菌、念珠菌属等有抑制作用；
[0040]
硫酸多粘菌素b对革兰氏阴性杆菌有抑制或杀菌作用。
[0041]
胰酶消化酪蛋白胨、酵母浸粉、牛心浸粉和玉米淀粉提供碳源、氮源、维生素和矿
物质，其中玉米淀粉能吸收培养基中衍化产生的毒性氧离子。氯化钠提供均衡的渗透压，无菌冻融脱纤维羊血提供丰富的营养物质，丙酮酸钠可以提高幽门螺旋杆菌的生长和耐气性，中和氧气的毒性作用和抗生素的抑制作用，从而提高幽门螺旋杆菌的产量，同时可以提供一部分能量，参与微生物营养代谢。
[0042]
关键的，本发明使用水溶性壳聚糖作为幽门螺旋杆菌培养基中碳源和氮源，水溶性壳聚糖相比可溶性淀粉更难以降解，本发明使用ca
2+
络合壳聚糖实现了壳聚糖在培养基体系中的溶胶状态，更有利于配方中无机盐等成分被充分利用，且减少了抑菌剂(抗生素)对幽门螺旋杆菌的胁迫作用，能进一步吸收幽门螺旋杆菌产生的毒性离子和细菌代谢产生的毒性产物，防止幽门螺旋杆菌过早处于胁迫条件。
[0043]
实施例1
[0044]
本实施例的选择性幽门螺旋杆菌培养基，成分及其含量如下：
[0045][0046][0047]
其余成分为纯化水。
[0048]
本实施例的抑菌剂按质量比，万古霉素：头孢磺啶：两性霉素b：甲氧苄啶：硫酸多粘菌素b＝2：5：3：2：1。
[0049]
本实施例选择性幽门螺旋杆菌培养基制备步骤如下：
[0050]
(1)0.2mg万古霉素、0.5mg头孢磺啶、0.3mg两性霉素b、甲0.2mg 氧苄啶和0.1mg硫酸多粘菌素b溶于水中，紫外照射灭菌30～60min，得到55mg/ml的抑菌剂溶液；
[0051]
(2)取0.5g玉米淀粉溶于500ml无菌水中，按上述的配方比例，依次加入1.5g牛心浸粉、2.5g酵母浸粉、2.5g氯化钠、1.75g蛋白胨、5g胰酶消化酪蛋白胨混合，加热100℃溶解，调整ph至7.2～7.5，灭菌；
[0052]
(3)灭菌后，加入7.5g琼脂，冷却至40～45℃，加入5g无菌冻融脱纤维羊血121℃，灭菌20min，冷却至40℃后加入，再加入12.5ml(1)中抑菌剂溶液，冷却至室温后加入。
[0053]
(4)壳聚糖于乙酸溶液中溶解得到5％壳聚糖乙酸溶液，50℃下加入 0.5ml 20％(体积)h2o2解聚至壳聚糖粘度为100
±
5pa
·
s，再加入50ml 70％(体积)乙醇，静置沉淀，离心去上清，烘干，得到沉淀，将沉淀按质量比1：1溶于水，取3ml，30℃下加入饱和氯化钙0.8ml络合，搅拌15min，得到水溶性壳聚糖，将3g水溶性壳聚糖加入(3)中的培养基，混合均匀，得到选择性幽门螺旋杆菌培养基。
[0054]
实施例2
[0055]
本实施例的选择性幽门螺旋杆菌培养基，成分及其含量如下：
[0056][0057]
其余成分为纯化水。
[0058]
本实施例的抑菌剂按质量比，万古霉素：头孢磺啶：两性霉素b：甲氧苄啶＝1：1：1：2。
[0059]
本实施例的选择性幽门螺旋杆菌培养基制备方法同实施例1相同，具体用量按本实施例成分的比例做适应性变动。
[0060]
实施例3
[0061]
本实施例的选择性幽门螺旋杆菌培养基，成分及其含量如下：
[0062][0063][0064]
其余成分为纯化水。
[0065]
本实施例的抑菌剂按质量比，万古霉素：头孢磺啶：甲氧苄啶＝1：1： 2。
[0066]
本实施例的选择性幽门螺旋杆菌培养基制备方法同实施例1相同，具体用量按本实施例成分的比例做适应性变动。
[0067]
对比例1
[0068]
对比例1采用市场上常见的国家卫生部门认可的某公司的幽门螺旋杆菌培养基(液体)。
[0069]
对比例1幽门螺旋杆菌培养基(液体250g规格)的组分及其含量如下：
[0070]
蛋白胨10.0g、牛脑浸出粉10.0g、牛心浸出粉9.0g、氯化钠5.0g、葡萄糖2.0g、磷酸氢二钠2.5g；
[0071]
幽门螺旋杆菌培养基(液体)的ph值为7.4
±
0.2
[0072]
使用方法：
[0073]
25℃用法称取本品3.85g，加热搅拌溶解于93ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷至50～55℃时，加入7ml无菌脱纤维羊血和1支hp抑菌剂，混匀，分装，备用。
[0074]
使用对比例1制备的幽门螺旋杆菌培养基(液体)对幽门螺旋杆菌进行培养，实验环境条件保持同实施例1一致。
[0075]
注：hp抑菌剂含萘啶酮酸1mg、tmp 0.5mg、万古霉素0.3mg。
[0076]
对比例2
[0077]
本对比例的选择性幽门螺旋杆菌培养基不添加水溶性壳聚糖，其余组分及其含量、培养基制备方法同实施例1相同。
[0078]
制备时，使用可溶性淀粉水溶液代替水溶性壳聚糖。
[0079]
特异性试验：
[0080]
为方便叙述，以下所述“实施例”及“对比例”无特殊说明外，也指由实施例或对比例制备的培养基培养得到的幽门螺旋杆菌及其菌悬液。
[0081]
采用实施例1～3和对比例1～2的培养基分别对革兰氏阴性菌(幽门螺旋杆菌)、革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)以及真菌(酿酒酵母)进行接种，观察菌株在培养基上的生长情况，检测结果如表1所示：
[0082]
表1特异性试验结果
[0083][0084]
由表1可以看出，上述实施例1～3所得培养基可以对非目标菌株(酿酒酵母、金黄色葡萄球菌)进行有效的抑制，与对比例1培养基结果一致。表明了本发明的幽门螺旋杆菌选择性培养基具有较强的特异性，可以特异性的降低非目标菌株的干扰。
[0085]
生长试验
[0086]
采用实施例1、实施例2、实施例3和对比例1的培养基接种幽门螺旋杆菌进行培养，观察其生长状况，检测结果如表2所示。
[0087]
表2生长率试验结果
[0088][0089]
由表2可以看出，上述实施例1、2和3所得培养基均能培养幽门螺旋杆菌，实施例1的生长率较对比例1的生长率较高，说明了本发明的选择培养基可以有效培养幽门螺旋杆菌，增加其生长率，将实施例1同对比例2比较，可以明显看出，水溶性壳聚糖的添加显著增加了幽门螺旋杆菌的生长率，这进一步表明了本发明培养基的各组分相互协同，缺一不可。
[0090]
稳定性试验
[0091]
采用实施例1、实施例2、实施例3和对比例1的培养基进行对照检测，开封处理，每隔一个月分别对各组幽门螺旋杆菌的生长进行检测，观察其生长情况的变化，检测结果如表3所示。
[0092]
表3生长率试验结果
[0093][0094]
由表2可以看出，上述实施例1和实施例3所得培养基在开封6个月后，其幽门螺旋杆菌的生长率基本保持不变，营养成分稳定，对比例2的培养基在开封4个月后并出现了生长率突然降低的情况，说明了由于缺少了水溶性壳聚糖对代谢产物的吸收，幽门螺旋杆菌受到了胁迫作用，导致生长率受到抑制。
[0095]
此外，从实施例2可以看出，本发明培养基的各组分相互协同，组分浓度的变动对长周期生长率的影响较大，综合来看本发明的实施例的培养基培养稳定性明显优于对比例1。
[0096]
综上所述，本发明的一种选择培养幽门螺旋杆菌的培养基具有较强的特异性，可以降低非目的菌株的干扰，增加对幽门螺旋杆菌的筛选，提高幽门螺旋杆菌的生长率，同时具有较好的稳定性，开封后可以长时间使用，并且可以在此基础上进行药敏检测，为临床药物的选择提供可靠依据。
[0097]
抑菌实验
[0098]
取实施例1～3和对比例1～2制备的培养基，放置于平板各3只，每只平皿中各加入104的稀释度的菌悬液0.1ml，用l棒涂布均匀(将菌悬液推干)。
[0099]
将平板置于37℃，混合气体(85％n2、10％co2、5％o2)，湿度90％的环境下培养48h后检测计数菌落、测量菌落的直径和杂菌菌落数。实验结果如下表4所示：
[0100]
表4各实施例和对比例的菌落实验结果
[0101] 菌落数菌落直径(mm)杂菌菌落数实施例1982.160-实施例2872.0787实施例3922.0024对比例1882.0105对比例2811.9886
[0102] 实施例1～3中幽门螺旋杆菌的菌落数和菌落直径均大于对比例2，这表明水溶性壳聚糖为培养基的碳源、氮源，促进的生长同时也减少样本中其他杂菌的生长，配合多种抑
菌剂抗生素，抑制可快速生长的兼性厌氧菌和霉菌，降低非目标菌株的干扰，还能够促进幽门螺旋杆菌的快速生长。
[0103]
实施例3中的培养基中添加的抗生素明显多于实施例1，因此也能够更好的抑制杂菌的生长，同时，也因为大量的抗生素的存在，也抑制了幽门螺旋杆菌的生长，这也是导致实施例3中的幽门螺旋杆菌的菌落数和菌落直径小于实施例1和实施例2的原因。
[0104]
明显的，本发明实施例2由于抑菌剂的变动导致杂菌菌落数变多，这表明本发明抑菌剂的比例及种类复配是具有协同效果的。
[0105]
将实施例1和对比例1对比发现，实施例1中没有杂菌的生长，说明水溶性壳聚糖配合抑菌剂(抗生素)进一步抑制杂菌的生长，比市面上的培养基有更突出的技术效果。
[0106]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。