抗草鱼白细胞介素-21单克隆抗体及应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种草鱼白细胞介素-21重组蛋白，分泌抗草鱼白细胞介素-21单克隆抗体杂交瘤细胞株，还涉及草鱼白细胞介素-21单克隆抗体的制备方法和应用。

背景技术：

1、草鱼(ctenopharyngodon idella)是我国淡水渔业中重要的养殖品种之一，常年稳居水产品产量首位，2020年我国草鱼养殖总产量约557.1万吨，占我国淡水养殖总产量的18.04％。草鱼由于饲料来源广，生长速度快，经济价值高，深受养殖者喜爱，但近年来草鱼病害频发，严重制约了草鱼养殖业的可持续发展。增强鱼类免疫防护能力与监测鱼体健康水平迫在眉睫，并且对于水产养殖业高质量和可持续发展也极为重要。

2、已有研究表明，细胞因子在鱼类免疫防控中扮演重要角色，其中白细胞介素-21(interle ukin-21,il-21)是一类重要的新型细胞因子，主要由激活的cd4+t细胞和nkt细胞等免疫细胞产生，参与调节多种免疫细胞的增殖、分化及功能，同时在炎症反应中发挥重要作用。用il-21单克隆抗体检测草鱼组织和血清中il-21水平可用于反映草鱼炎症反应过程。目前已开发有哺乳类动物il-21单克隆抗体，但由于序列同源性低，无法识别抗原表位，故不能应用于鱼类检测。草鱼特异性抗体的缺乏限制了草鱼il-21的检测，因此，亟需研发特异性强且效价高的il-21单克隆抗体用于检测草鱼组织和血清中il-21的水平，为监测草鱼及其他鲤科鱼类炎症过程提供参数指标，对于炎症性疾病的防治具有潜在的应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术中的不足，本发明提供了一种抗草鱼il-21单克隆抗体及应用。

2、为达到上述目的，本发明的解决方案是：

3、第一方面，本发明提供了一种抗草鱼白细胞介素-21单克隆抗体，该抗草鱼白细胞介素-21单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌得到，并使用fitc荧光染料对制备的抗草鱼il-21单克隆抗体进行标记，杂交瘤细胞株命名为gc9-il21，并于2022年08月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学，保藏编号为：cctcc no：c2022214。抗草鱼白细胞介素-21单克隆抗体特异性识草鱼白细胞介素-21重组蛋白。

4、纯化单克隆抗体：使用hitrap rprotein a ff色谱柱通过亲和纯化得到高纯度(＞90％)的抗草鱼il-21单克隆抗体，且经elisa检测抗体亲和常数为1.14e+09，经wb检测均可特异性地识别草鱼il-21重组蛋白，而不与草鱼的其他蛋白发生反应，并用fitc荧光染料标记抗草鱼il-21单克隆抗体，以应用于后续的免疫荧光实验。

5、第二方面，本发明提供了一种抗草鱼白细胞介素-21单克隆抗体的应用，该抗草鱼白细胞介素-21单克隆抗体在制备检测草鱼白细胞介素-21蛋白的试剂或试剂盒中的应用。

6、第三方面，本发明提供了一种检测草鱼白细胞介素-21蛋白的试剂或试剂盒，其包括上述的草鱼白细胞介素-21单克隆抗体。

7、第四方面，本发明提供了一种草鱼白细胞介素-21单克隆抗体的应用，该草鱼白细胞介素-21单克隆抗体在酶联免疫吸附剂(elisa)测定、蛋白质印迹法(western blot)、免疫荧光测定、免疫组织化学(ihc)(即通过制备冷冻组织切片，利用激光共聚焦观察组织中il-21分布的情况，为监测草鱼炎症提供参数指标，可实时监测草鱼的健康状况)或流式细胞术检测中的应用。

8、第五方面，本发明提供了一种分泌草鱼白细胞介素-21单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏编号为：cctcc no：c2022214。

9、优选地，杂交瘤细胞株的制备方法为：草鱼白细胞介素-21重组蛋白注射小鼠腹腔，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选，纯化，得到杂交瘤细胞株。

10、具体地，

11、免疫小鼠：选4只spf balb/c雌性小鼠，共免疫4次，免疫周期为14天，首次免疫每只皮下注射60μg草鱼il-21重组蛋白，加强免疫每次30μg/只；最后一次免疫10天后将小鼠麻醉后眼眶取血，并用elisa测定免疫小鼠效价。

12、细胞融合：融合前经腹腔注射50μg草鱼il-21重组蛋白冲击免疫小鼠，取小鼠脾细胞与sp2/0细胞，采用peg法进行融合，将融合后的细胞转到半固体培养基中培养。

13、筛选阳性杂交瘤细胞：将半固体培养基上生长的单克隆挑到96孔培养板中进行培养，对挑选的克隆采用酶联免疫吸附剂(elisa)方法，进行两次筛选和亚类鉴定，最后得到七株igg类型阳性杂交瘤细胞株，并将其大量培养后冻存于本实验室。

14、优选地，草鱼白细胞介素-21重组蛋白的制备方法包括：草鱼白细胞介素-21基因重组在pet-21d质粒中得到重组体，转入感受态细胞de3中，纯化得到草鱼白细胞介素-21重组蛋白，并进行纯化，活性鉴定与保存。草鱼白细胞介素-21基因的碱基序列如seq id no.1所示。

15、其中，草鱼il-21基因碱基序列：

16、atgaaggcatccgtgtttgttctgttcgcagtggcgtgttggttcgtttcgcaggcagagctgtcgccgatgcaactcacgctcagaaaagttatgaatgaactcgagaaggtcaataacgtaatggacaaaagcacaagttcgttcaactcacccaccaccaacgatttgaaggactgctgcatcagatctgctctggagtgctttaggtcccaagtgatgaacctgaatgtcactcaagagaaacctataataaagtcactgaagagcatctccaacgagtcccgaaaaaaagtcattgtggaaaagttgcccagttgcaacctggtagaaggtgagaaaaaggaagctcagtgcaaaccctgtgaatcgtacagcaaggttaacagccaaatgttcgtgcagaactttcaaactcttcttcaaaagatctatgccagtcaagcatag(下划线依次为启动子和终止密码子)。

17、优选地，草鱼白细胞介素-21重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

18、其中，草鱼il-21重组蛋白的氨基酸序列：

19、mkasvfvlfavacwfvsqaelspmqltlrkvmnelekvnnvmdkstssfnspttndlkdccirsalecfrsqvmnlnvtqekpiikslksisnesrkkviveklpscnlvegekkeaqckpcesyskvnsqmfvqnfqtllqkiyasqa*。(下划线为信号肽，*为终止密码子，其余为成熟肽。)

20、优选地，草鱼白细胞介素-21重组蛋白在疫苗分子佐剂制备中的应用。

21、由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

22、本发明制备的草鱼il-21重组蛋白经akta pure蛋白纯化系统凝胶过滤层析纯化后在sds-page电泳上为单一条带，纯度较高且具有生物活性。采用草鱼il-21重组蛋白作为抗原免疫小鼠后筛选得到能特异性分泌抗草鱼il-21单克隆抗体igg类型的阳性杂交瘤细胞株。利用杂交瘤细胞株gc9-il21制备出的抗草鱼il-21单克隆抗体(9#)经sds-page、elisa和western blot检测纯度较高(＞90％)，亲和常数为1.14e+09，可特异性识别草鱼il-21重组蛋白，说明其检测灵敏度和精确度较高。因此，草鱼il-21重组蛋白可应用于疫苗分子佐剂以提高疫苗免疫保护效果；抗草鱼il-21单克隆抗体可应用于western blot检测草鱼il-21蛋白，还可经elisa特异性检测草鱼血清中il-21浓度，通过冷冻组织切片检测组织中il-21产生的情况，为监测草鱼炎症提供参数指标，可实时监测草鱼的健康状况，从而为草鱼养殖业的可持续发展提供技术支撑。