一种高灵敏度甘胆酸单链抗体及其筛选方法与应用

本发明属于基因工程、抗体工程和免疫学检测领域，涉及一种以异源包被抗原筛选高灵敏度甘胆酸单链抗体的方法。

背景技术：

1、甘胆氨酸(glycocholicacid,gca)，属于二级胆酸，是类固醇酸的衍生物，由胆酸和甘氨酸在肝脏中结合生成的结合型胆酸，是胆汁酸的主要成分之一。gca具有促进脂类乳化，加速脂类物质的消化和吸收的作用。甘胆氨酸在血液和尿液中的浓度高低与肝细胞损害及胆汁酸代谢障碍的严重程度相关。因此，建立甘胆氨酸检测方法对其进行有效监测可以为各类肝脏疾病的鉴别、诊断、治疗和预后分析提供重要的依据。

2、目前，gca的检测方法主要包括高效液相色谱法、液质联用法、免疫学分析法等等。免疫分析法基于抗体和抗原之间特异性结合，具有灵敏度高、特异性强、简单、快速和便宜等优点，特别适用于大批量样本的筛查。

3、抗体是影响免疫分析方法特异性和灵敏性的重要因素之一。传统的抗体包括多克隆抗体(polyclonalantibodies，pab)和单克隆抗体(monoclonalantibodies，mab)；然而，这两种抗体存在着某些缺点，例如在多克隆抗体制备中批次与批次之间的差异；在单克隆抗体制备中耗时、生产成本高和步骤复杂等等。通过噬菌体展示技术，可以从抗体文库中淘选到具有高亲和力的重组抗体，并可通过测序获得抗体的编码序列。单链抗体(single-chianvariablefragment，scfv)是最常见的重组抗体之一，是能够保持与抗原有效结合的最小单位，由轻链和重链抗体可变区通过一段编码连接肽基因拼接后表达的重组蛋白。单链抗体具有易于原核表达和基因工程改造等优点，目前已广泛应用于医疗诊断、疾病治疗、环境监测和食品安全分析等领域。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，本发明的第一个目的是提供一种具有高灵敏性，可用于甘胆酸的快速免疫检测的高灵敏度甘胆酸单链抗体。

2、本发明的第二个目的是以异源包被抗原筛选高灵敏度甘胆酸单链抗体的方法。

3、为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

4、一种高灵敏度甘胆酸单链抗体，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、进一步的，上述的高灵敏度甘胆酸单链抗体，其核苷酸序列为seq id no.2所示。

6、进一步的，上述的高灵敏度甘胆酸单链抗体，所述的氨基酸序列由核苷酸序列如seq id no.3所示的重链可变区、核苷酸序列如seq id no.4所示的连接肽和核苷酸序列如seq id no.5所示的轻链可变区组成，所述的连接肽位于重链可变区和轻链可变区之间。

7、本发明提供的第二个技术方案是这样的：

8、第一个技术方案提供的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，依次包括下述步骤：

9、1)合成免疫抗原

10、首先制备半抗原，将半抗原溶于溶液中，加入二环己基碳二亚胺和nhs，室温下搅拌反应；最后，离心取上清滴入牛血清白蛋白中，室温下搅拌反应，在pbs中透析得到异源包被抗原；

11、2)动物免疫

12、免疫宿主用磷酸盐缓冲液对甘胆酸免疫抗原进行稀释为1mg/ml，与等体积的弗氏佐剂乳化后进行免疫来亨鸡5次；

13、3)抗体库的构建

14、分离免疫后的来亨鸡脾脏的淋巴细胞，提取总rna并逆转录合成cdna，扩增重链可变区vh和轻链可变区vl基因，通过overlappcr组装成scfv，与pcom3x质粒连接，点击转化至ecolier2738感受态细胞中，构建原始抗体文库，并加入辅助噬菌体vcsm13，得到噬菌体抗体文库；

15、4)特异性单链抗体的淘选

16、利用步骤1)制备的异源包被抗原包被酶标板，加入噬菌体抗体文库，室温下孵育1小时，用pbst洗涤未结合的噬菌体，然后添加甘胆酸洗脱结合的噬菌体，重复上述操作4次，筛选出灵敏度较高的噬菌体；

17、5)特异性单链抗体的表达

18、提取阳性噬菌粒，热击转化至e.colitop10f′表达宿主菌中，加入iptg诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，利用镍亲和层析柱进行纯化，得到高灵敏的抗甘胆酸单链抗体。

19、优选的，上述的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，将2g甘胆酸溶于10ml甲醇中，加入0.3ml浓硫酸，100℃加热回流进行酯化反应，利用乙酸乙酯进行萃取得到甘胆酸甲酯；然后，将0.1g甘胆酸甲酯溶于100ml氯仿中，在0.1ml三乙胺的催化作用，与0.2g琥珀酸酐进行反应，得到半抗原。

20、优选的，上述的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，所述的免疫抗原通过下述方法制得：将0.11mmol甘胆酸溶于1mldmf中，加入0.22mmoldcc和0.22mmolnhs，室温下搅拌反应，离心取上清滴入5.5μmol卵清白蛋白，室温下搅拌反应，在pbs中透析得到包被抗原。

21、优选的，上述的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，所述的扩增重链可变区vh和轻链可变区vl基因的方法用核苷酸序列如seq id no.6所示的上游引物cscvho-f和核苷酸序列如seq id no.7所示的下游引物cscg-b扩增抗体重链可变区基因；利用核苷酸序列如seq id no.8所示的上游引物cscvk和核苷酸序列如seq id no.9所示的下游引物ckjo-b扩增抗体轻链可变区基因vl。

22、优选的，上述的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，所述的增重链可变区vh和轻链可变区vl基因的体系如下：

23、10×pcr缓冲液1μl，

24、10mmdntpmix 1μl，

25、10μm上游引物1μl，

26、下10μm游引物1μl，

27、cdna 500ng；

28、taqdna酶1μl,

29、灭菌水to50μl；

30、扩增条件：

31、预变性98℃，120s；

32、变性98℃，30s；

33、退火56℃15s；

34、延伸72℃90s；

35、重复变性、退火、延伸25个循环；

36、最后延伸72℃10min

37、冷却4℃+∞。

38、优选的，上述的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，所述的overlappcr组装成scf的方法为：

39、1)将10×bufferm20μl，pcomb3x质粒orscfv基因片段10μg，sfii内切酶18μl，添加到pcr管，再rasefreeddh2oupto200μl；在50℃孵育过夜，然后切胶回收酶切产物；

40、2)载体pcomb3x和单链基因片段的连接

41、在pcr管中装入sfii酶切的pcomb3x载体600ng，sfii酶切的scfv片段1320ng，10×ligase缓冲液20μl，t4dna连接酶10μl，rnasefreedh2o up to 200μl，将pcr管置于pcr仪中，16℃反应过夜；在65℃下，热灭活t4dna连接酶10分钟，置于-20℃保存；将3μl连接产物加入e.colier2738电转化感受态细胞中，冰浴30分钟；转移至冷却的电击杯中，进行电击转化；加入1ml37℃预热的sb培养基，并重悬转化后的细胞；将转化后的细胞置于摇床中，37℃250转/min振荡复苏1小时，使大肠杆菌的抗性基因表达；加入200μl浓度50μg/ml羧苄青霉素和200μl浓度20μg/ml四环素，继续培养2小时。

42、本发明提供的高灵敏度甘胆酸单链抗体在甘胆酸检测中的应用。

43、与现有的方法相比，本发明减少了筛选过程中非目的抗体的干扰，可快速筛选具有高灵敏度的单链抗体，适用于甘胆酸的快速免疫检测，具有良好的应用价值。