一种快速检测与GBS相关的易感基因Siglec14/5及其融合突变的方法与流程

本发明涉及生物化学，具体涉及一种快速检测与gbs相关的易感基因siglec14/5及其融合突变的方法。

背景技术：

1、b族链球菌(gbs)属于育龄女性常见的条件致病菌，在非孕妇的携带率约为35％，孕妇的携带率约为20～26％。孕妇有感染gbs可能会造成流产，早产、胎儿感染和胎儿损伤等严重后果。gbs致病性与宿主天然免疫系统密切相关，可以通过其表面的蛋白(cba基因编码的表面蛋白βprotein)与中性粒细胞表面一对功能相反的唾液酸黏附蛋白受体(siglec-5和siglec-14) 相互作用，激活或者抑制宿主免疫反应。

2、siglec-5和siglec-14在同一条染色体上，两个基因前后顺序排列，它们的5’端编码胞外序列的基因完全一致，而3’端编码胞内尾部序列差异较大，因此他们行使的功能大相径庭，siglec-5主要起到免疫抑制功能，而siglec-14 主要起到免疫激活功能，二者的启动子序列也存在较大差异，在基因复制的过程中，由于siglec-5和siglec-14存在较长的同源序列，容易发生同源重组，导致siglec-5的尾部重组至它们的一致性序列之后，使siglec-14发生缺失突变，siglec-5利用siglec-14的启动子进行表达，仅产生siglec-5的表型(图 1)。

3、当女性的天然免疫系统的中性粒细胞表面行使免疫应答的激活受体 siglec-14在同源重组过程中与相似抑制受体siglec-5的发生融合突变，使得中性粒细胞仅存在siglec-5基因，gbs与siglec-5相结合，抑制了中性粒细胞对gbs的吞噬活性，造成了gbs的免疫逃逸，使其在宿主体内引起严重侵入感染或者传递至新生儿中，引起更严重的后果。

4、野生型siglec-5和siglec-14在同一条染色体上，两个基因前后顺序排列，它们之间的基因组非编码区序列长度大于15000bp，此片段在siglec5和 siglec14发生融合后被删除，形成siglec-14缺失突变型。由于siglec-14和 siglec-5野生型与siglec-14缺失突变型存在大量的一致性序列，其融合区域的长度大于1299bp，一致性大于99％，对于其检测存在较大的阻碍，利用普通的qpcr方法无法正常检测，目前的检测方法多数是通过普通pcr扩增，针对启动子和尾部序列的差异，分别设计引物进行扩增，将pcr产物进行电泳检测，通过序列长度和条带数量区分野生型，突变型和杂合型基因。但是pcr实验操作复杂，需要电泳检测及利用肉眼对条带进行判断，不仅耗时耗力，还很容易发生污染，非常不利于大范围推广，目前尚未出现该类体外诊断检测。由于siglec-5和siglec-14胞外受体部分存在部分差异，可以利用特异性抗体进行识别，但是抗体孵育时间长，干扰大，容易引起非特异性结合，并且需要分离完整细胞进行检测，操作难度大，不利于医疗诊断及大规模推广。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测与gbs相关的易感基因 siglec14/5及其融合突变的方法，检测快速、灵敏，成本低，便于推广。

2、基于上述问题，本发明提出的技术方案是提供一种快速检测与gbs相关的易感基因siglec14/5及其融合突变的方法。

3、向同一管中添加三组引物及探针，连续进行pcr和qpcr两轮反应，所述引物包括第一轮siglec14/5融合突变基因pcr扩增引物、第二轮靶向融合突变基因的qpcr检测引物和探针、以及靶向野生型正常siglec14与siglec5 基因之间非编码区序列的qpcr检测引物和探针。

4、其中，第一轮pct引物tm值高于第二轮qpcr引物tm值，两轮反应均分别经过高温变性和退火延伸的过程，且第一轮pcr的退火温度大于第二轮退火温度。

5、在第二轮qpcr中利用荧光信号的不同一次性对siglec基因的野生型、缺失突变型、杂合型进行有效区分。

6、其中，siglec融合基因检测所用的引物和探针可选用表1或表2中所示的引物与探针，各引物与探针的具体序列如表1或表2所示：

7、表1 siglec融合基因检测所用的引物和探针

8、

9、

10、表2 siglec融合基因检测所用的另一组引物和探针

11、

12、其中，探针可以是普通taqman探针或相同序列的mgb探针，探针可以是fam、vic、cy5、rox、syto-9通道中任意两种不同的标记。

13、具体反应过程如图2所示，第一轮pcr扩增的上游引物靶向siglec14 基因启动子区域，下游引物靶向siglec5基因的下游编码区，只有发生融合的基因才可被正常扩增，扩增长度为2672bp，而未发生融合的基因两个引物之间的长度为16933bp，在我们设定的延伸时间内无法正常扩增。其pcr下游引物由三部分组成。r部分为siglec-5基因的特异引物，a部分为第二轮 qpcr的探针靶向区域，该区域是人为添加且不与siglec同源的dna序列； o部分为第二轮qpcr检测的下游引物互补序列，同样为人为添加的非siglec 同源dna序列，在野生型和siglec-14缺失突变型中均存在引物r部分结合序列，但是由于未融合的基因长度远远大于融合后的基因长度，在优化的退火和延伸条件中仅可以扩增出siglec-14缺失突变型片段，长度为2672bp。新生成的pcr产物掺入了下游引物中人为添加的序列，由于第一轮pcr设计的引物tm值远远高于第二轮qpcr的引物tm值，保证在第一轮扩增过程中，第二轮qpcr检测的引物探针无法进行扩增。第二轮qpcr中的下游引物是在最初体系配制时同时加入，但是仅有当第一轮pcr实际进行后，退火温度降低后，才会被第二轮的qpcr检测到，在第二轮qpcr时，根据所采集荧光信号，判定待测样本中siglec的基因型。

14、第二轮qpcr扩增可以对野生型siglec-14和siglec-5之间的序列进行扩增，如果有正常扩增的荧光信号，则判断为存在野生型基因；如果siglec14 缺失突变融合基因被正常扩增，以其为模板，上游引物识别siglec14/5缺失融合基因的3’端序列，下游引物识别人为添加序列o区域，探针识别人为添加序列a区域，进行扩增，如果有如果有正常扩增的荧光信号，则判断为存在突变型基因；如果野生型和突变型基因信号同时存在，则判断为杂合基因型。

15、其中，检测易感基因siglec14/5所依赖的pcr和qpcr两轮反应的步骤见表3-1所示：

16、表3-1反应条件

17、

18、检测易感基因siglec14/5所依赖的pcr和qpcr两轮反应的优选步骤见表3-2所示：

19、表3-2反应条件

20、

21、检测易感基因siglec14/5所依赖的pcr和qpcr两轮反应的另一优选步骤见表3-3所示：

22、表3-3 qpcr反应条件

23、

24、第二轮qpcr检测，fam荧光标记的探针siglec-gap-p靶向野生型正常siglec14与siglec5基因之间非编码区序列，用来检测野生型基因，vic 荧光标记的探针siglec-s-p靶向融合突变基因的o区域，用来检测突变型基因。以h2o为模板的阴性对照以质控整个检测过程，仅在fam通道内有典型的s型扩增曲线的为野生型，仅在vic通道内有典型的s型扩增曲线的为突变型，fam和vic通道均有典型的s型扩增曲线的为杂合型，如图3 所示。

25、上述方法所依赖的检测样本可采用阴道分泌物，血液，羊水，尿液，粪便。

26、本发明的优点和有益效果：

27、本发明提供了一种快速检测与gbs相关的易感基因siglec14/5及其融合突变的方法，即向同一管中添加第一轮siglec14/5融合突变基因的pcr扩增引物、第二轮靶向融合突变基因的qpcr检测引物和探针、以及靶向野生型正常siglec14与siglec5基因之间非编码区序列的qpcr检测引物和探针，通过调整变性-退火-延伸各反应步骤的温度变化，连续进行pcr和qpcr两轮反应，互相无干扰，利用荧光信号的不同一次性做到对siglec14/5基因的野生型、缺失突变型、杂合型进行有效区分。本技术较传统pcr加电泳法速度更快，操作更加方便，检测过程全程闭管，不容易产生气溶胶污染，易于大范围推广。