一种天然活性小分子化合物、组合物、提取物及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种天然活性小分子化合物、组合物、提取物及其应用。


背景技术：

2.皮肤中活性氧积聚、dna损伤、黑色素沉积、胶原蛋白、弹性蛋白和细胞外基质合成能力下降，皮肤弹性及防御能力降低等多种因素都是诱发皮肤衰老的原因。皮肤衰老多表现为干燥缺水、胶原蛋白流失以及皱纹斑点增多，严重的还会出现皮肤的粗糙、暗淡以及松弛等。
3.随着年龄增长，皮肤的细胞活力以及皮肤细胞增殖能力均下降，因此导致皮肤细胞的新陈代谢能力下降；进而导致粗糙、暗淡以及松弛的皮肤无法得到及时的修复；进而导致了皮肤的衰老。
4.然而，现有技术鲜有报道天然活性小分子化合物具有促进皮肤细胞增殖以及提高皮肤细胞活力的作用。因此，提供一种具有促进皮肤细胞增殖或提高皮肤细胞活力的作用的天然活性小分子化合物具有重要的应用价值。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明首先提供了一种天然活性小分子化合物。研究表明所述的天然活性小分子化合物不仅能够促进皮肤细胞增殖，同时还能够提高皮肤细胞活力。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种天然活性小分子化合物，其具有式ⅰ或式ⅱ所示的结构；
8.[0009][0010]
发明人在研究中惊奇的发现，式ⅰ和式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物具有促进皮肤细胞增殖的作用，同时还具有提高皮肤细胞活力的作用。
[0011]
本发明还提供一种组合物，其包含式ⅰ和式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物。
[0012]
发明人在研究中进一步惊奇的发现，将式ⅰ和式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物组合后形成的组合物，其促进皮肤细胞增殖作用以及提高皮肤细胞活力作用得到了进一步提高，其促进皮肤细胞增殖作用以及提高皮肤细胞活力作用要显著高于单独的式ⅰ或式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物。
[0013]
优选地，式ⅰ和式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物的重量比为1～10:1～10。
[0014]
进一步优选地，式ⅰ和式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物的重量比为1～3:1～3。
[0015]
最优选地，式ⅰ和式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物的重量比为1:1。
[0016]
本发明还提供了一种提取物，其特征在于，包含式ⅰ和/或式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物。
[0017]
优选地，式ⅰ和/或式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物在提取物中的重量含量为1～99％。
[0018]
进一步优选地，式ⅰ和/或式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物在提取物中的重量含量为30～95％。
[0019]
更一步优选地，式ⅰ和/或式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物在提取物中的重量含量为50～90％。
[0020]
优选地，所述的提取物为滨海刺芹提取物。
[0021]
本发明还提供了一种上述天然活性小分子化合物、组合物或提取物在制备具体促进皮肤细胞增殖和/或提高皮肤细胞活力作用的产品中的应用。
[0022]
优选地，所述的产品为化妆品、护肤品或药品。
[0023]
优选地，所述的化妆品、护肤品或药品为外用制剂。
[0024]
优选地，所述外用制剂的剂型为喷剂、霜、慕斯、乳剂或液体制剂。
[0025]
有益效果：本发明提供了一种全新结构的天然活性小分子化合物；研究表明所述的天然活性小分子化合物同时具有促进皮肤细胞增殖作用以及提高皮肤细胞活力作用；尤其是将式ⅰ和式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物组合后形成的组合物，其促进皮肤细胞增殖作用以及提高皮肤细胞活力作用得到了进一步提高，具有更加优异的促进皮肤细胞增殖作用以及提高皮肤细胞活力作用；其促进皮肤细胞增殖作用以及提高皮肤细胞活力作用要显著高于单独的式ⅰ或式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物。由于式ⅰ或式ⅱ所示结
构的天然活性小分子化合物或其组合物具有促进皮肤细胞增殖作用以及提高皮肤细胞活力作；因此，将式ⅰ或式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物或其组合物或含有式ⅰ和/或式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物的提取物作为活性成分，用于制备具体促进皮肤细胞增殖和/或提高皮肤细胞活力作用的为化妆品、护肤品或药品具有重要的应用价值。
附图说明
[0026]
图1为式i所示结构的天然活性小分子化合物(滨海刺芹活性物-1)的1h-nmr图。
[0027]
图2为式i所示结构的天然活性小分子化合物(滨海刺芹活性物-1)的
13
c-nmr图。
[0028]
图3为式i所示结构的天然活性小分子化合物(滨海刺芹活性物-1)的dept图。
[0029]
图4为式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物(滨海刺芹活性物-2)的1h-nmr图。
[0030]
图5为式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物(滨海刺芹活性物-2)的
13
c-nmr图。
[0031]
图6为式ⅱ所示结构的天然活性小分子化合物(滨海刺芹活性物-2)的dept图。
具体实施方式
[0032]
下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033]
实施例1天然活性小分子化合物的制备
[0034]
(1)新鲜滨海刺芹5kg，粉碎，用体积分数为45％的乙醇的渗漏提取24h，分别减压浓缩提取液，得浸膏；
[0035]
(2)将浸膏用水溶解得混悬液，并分别用乙酸乙酯、氯仿萃取；萃取物冻干，分别得到乙酸乙酯、氯仿及水层浸膏；
[0036]
(3)将氯仿浸膏用硅胶柱色谱分离，用乙酸乙酯-甲醇(100∶1
→
30∶100)梯度洗脱获得13个馏分(fr.1～13)。
[0037]
(4)将fr.6(55g)经反复硅胶色谱柱，氯仿-甲醇(100∶10
→
10∶100)梯度洗脱分离纯化，得到天然产物-1(2154mg)，天然产物-2(3263mg)。
[0038]
天然产物-1以及天然产物-2的结构解析如下：
[0039]
天然产物-1：淡黄色油状物，易溶于氯仿、甲醇等有机溶剂。esi-ms m/z 623.5[m+na]
+
，结合氢谱、碳谱信息推测其分子式为c
35h52
o8，分子量为600，不饱和度为10。
[0040]1h nmr(400mhz,cdcl3)谱中显示该化合物含有7个甲基质子信号[δh1.80(3h,s),1.76(3h,s),1.72(3h,s),1.28(3h,s),1.24(3h,s),0.85(3h,d,j＝4.5hz),0.84(3h,t,j＝4.8hz)]，3个烯氢质子信号[δ
h 7.56(1h,s),5.66(1h,d,j＝5.1hz),6.79(1h,m)]，3个连氧碳上的质子信号[δ
h 5.42(1h,d,j＝10.2hz),4.02(1h,d,j＝12.9hz),3.93(1h,d,j＝12.9hz)]。
[0041]
13
c nmr和dept-135(100mhz,cdcl3)谱显示该化合物共有35个碳信号，其中，化学位移为δ
c 209.5,176.7,168.0的3个碳信号是羰基碳信号，化学位移为δ
c 161.2,140.7,137.7,133.0,129.6,128.7的6个碳信号是双键烯碳信号，化学位移为δ
c 78.6,77.0,73.9,68.2,65.7的5个碳信号是连氧碳信号，化学位移为δc24.0,17.1,14.6,14.5,14.3,12.4,
10.3的7个碳信号是甲基碳信号。
[0042]
结合不饱和度，1h nmr数据，可推测化合物为4环母核的二萜，且有2个酯基取代。其中，化学位移为δ
c 168.0,128.7,137.7,12.4,14.6的5个碳信号是tiglyl基团碳信号，化学位移为δ
c 176.7,34.6,32.0,29.6,29.5,29.4,29.3,24.8,22.9,14.5的10个碳信号是decanoyl基团碳信号。最终，确定化合物为式i所示结构的天然活性小分子化合物，本发明中将其命名为滨海刺芹活性物-1，其1h nmr、
13
c nmr数据见(表1)。
[0043]
表1滨海刺芹活性物-1 1
h及
13
c nmr数据(400mhz,cdcl3)
[0044]
[0045][0046]
天然产物-2：淡黄色油状物，溶于氯仿、甲醇等有机溶剂。esi-ms m/z 611.3[m+na]
+
，结合氢谱、碳谱信息推测其分子式为c
34h52
o8，分子量为588，不饱和度为9。
[0047]1h nmr(400mhz,cdcl3)谱中显示该化合物含有6个甲基质子信号[δh2.05(3h,s),1.76(3h,br s),1.23(3h,s),1.19(3h,s),0.86(3h,d,j＝6.6hz),0.86(3h,t,j＝6.9hz)]，2个烯氢质子信号[δ
h 7.57(1h,s),5.66(1h,d,j＝4.2hz)]，3个连氧碳上的质子信号[δ
h 5.35(1h,d,j＝10.5hz),4.03(1h,d,j＝13.2hz),3.96(1h,d,j＝13.2hz)]。
[0048]
13
c nmr和dept-135(100mhz,cdcl3)谱显示该化合物共有34个碳信号，其中，化学位移为δ
c 209.2,176.0,171.1的3个碳信号是羰基碳信号，化学位移为δ
c 161.0,140.6,133.1,129.4的4个碳信号是双键烯碳信号，化学位移为δc78.4,77.2,73.9,68.1,65.5的5个碳信号是连氧碳信号，化学位移为δ
c 24.1,22.9,21.3,17.0,14.6,10.3的6个碳信号是甲基碳信号。结合不饱和度，1h nmr数据，可推测化合物为4环母核的二萜，且有2个酯基取代。其中，化学位移为δ
c 171.1,21.3的2个碳信号是acetyl基团碳信号，化学位移为δ
c 176.0,34.6,32.1,29.8,29.7,29.6,29.5,29.3,24.7,22.9,14.3的11个碳信号是dodecanoyl基团碳信号。
[0049]
最终，确定化合物为式i所示结构的天然活性小分子化合物，本发明中将其命名为滨海刺芹活性物-2，其1h nmr、
13
c nmr数据见(表2)。
[0050]
表2滨海刺芹活性物-2 1
h及
13
c nmr数据(400mhz,cdcl3)
[0051]
[0052][0053]
效果实验例1促进皮肤细胞增殖以及提高细胞活力活性实验
[0054]
该实验测试的对象为滨海刺芹活性物-1、滨海刺芹活性物-2及其组合物(所述的组合物由滨海刺芹活性物-1和滨海刺芹活性物-2按重量比为1:1组成)。
[0055]
实验方法如下：
[0056]
人皮肤成纤维细胞培养于mem培养基，co2培养箱中(5％胎牛血清，5％co2，湿度95％，恒温37℃)培养24h。然后，96孔板，1
×
103细胞/孔，细胞附着后，各组中分别加入滨海刺芹活性物-1、滨海刺芹活性物-2或组合物溶液，使其终浓度为1.0mg/ml，空白对照组加入相同体积的pbs缓冲液，继续培养24h。
[0057]
①
wst-8法测定细胞数：向96孔板各孔中加入wst-8溶液10μl，重新放回培养箱中孵育，进行显色，4h后取出，450nm下测定od值。
[0058]
②
cck 8法测定细胞活力：参考使用说明cck8试剂盒测定细胞活力。
[0059]
实验结果显示(表3)，滨海刺芹活性物-1、滨海刺芹活性物-2及组合物组细胞的增
殖活性明显强于空白对照组(空白组增殖活性设为100％)。与空白组相比，滨海刺芹活性物-1、滨海刺芹活性物-2及组合物处理后，细胞增殖活性分别提高11.3％(p《0.05)，11.7％(p《0.05)及21.9％(p《0.01)，说明滨海刺芹活性物-1、滨海刺芹活性物-2及组合物能够促进人皮肤成纤维细胞的增殖。进一步分析实验结果发现，组合物提高人皮肤成纤维细胞的增殖能力优于同浓度条件下的滨海刺芹活性物-1或滨海刺芹活性物-2。
[0060]
类似的，双歧杆菌活性肽、滨海刺芹活性物-1、滨海刺芹活性物-2及组合物组细胞活力明显高于空白对照组(空白组细胞活力设为100％)。与空白组相比，滨海刺芹活性物-1、滨海刺芹活性物-2及组合物处理后，细胞活力分别提高18.1％(p《0.01)，19.2％(p《0.05)及31.0％(p《0.01)，说明滨海刺芹活性物-1、滨海刺芹活性物-2及组合物能够提高人皮肤成纤维细胞的细胞活力。进一步分析实验结果发现，组合物提高人皮肤成纤维细胞的细胞活力的能力优于同浓度条件下的滨海刺芹活性物-1或滨海刺芹活性物-2。
[0061]
表3促进皮肤细胞增殖以及提高细胞活力实验结果
[0062][0063]
*
，相比于空白组，p《0.05；
**
，相比于空白组，p《0.01。
[0064]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。