一种高纯度窄分子量分布的甲氧基聚乙二醇-聚（L-谷氨酸钠）的制备方法和应用与流程

本技术涉及一种高纯度窄分子量分布的甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸钠) 的制备方法和应用，属于纳米药物载体。

背景技术：

1、纳米制剂是指运用纳米化技术研究开发的一类新型药物制剂，药物溶解、分散或化学键合等方式与载体结合，药物起治疗作用，载体起包埋药物和输送作用，与传统药物制剂相比，具有较好的溶解性、较高的生物利用度、缓控释和肿瘤靶向性等特点，在肿瘤临床治疗方面极具发展潜力和应用前景。聚合物胶束是由嵌段共聚物在水溶液中自组装形成的分子有序聚集体，具有经典的“核-壳”结构，其凭借良好的生物相容性、结构易修饰等特点被视为纳米药物的理想载体之一。

2、甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸钠)(mpeg-p(l-glu-na))是一种线性聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物，可以自组装成胶束，其中聚(l-谷氨酸钠)片段具有悬垂的羧酸阴离子侧基，可用于药物结合和核心修饰，目前正在进行三期临床实验的顺铂胶束制剂nc-6004正是此类聚合物通过羧基与顺铂配位形成聚合物胶束，促进顺铂传递至肿瘤部位。

3、但近期研究表明，聚合物胶束纳米药物往往在体外实验中抑瘤效果显著，而当用于体内或临床试验后却并没有表现令人期待的效果(appl.mater.inter faces 2019,11,23,20649–20659)。其中一个重要因素，当用于纳米药物载体的嵌段聚合物分子量分布宽、纯度低时，以此制备得到的聚合物胶束纳米药物粒径分布广，在面对体内循环系统长距离运输过程中各种因素的干扰时，导致部分粒径的纳米药物在体内循环过程中稳定性差，存在突释、渗漏以及提前酶解等现象，致使到达病灶部位药物浓度不足，并对正常组织或器官造成损伤，进而表现出药物主动靶向性不足、疗效降低或没有疗效。因此，嵌端共聚物载体的纯度和分子量分布是影响聚合物胶束纳米药物的稳定性并制约其疗效的关键因素之一，这也是目前限制聚合物胶束纳米药物广泛应用的主要因素之一。

4、甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸钠)(mpeg-p(l-glu-na))的化学结构式如下：

5、

6、现有技术中相关mpeg-p(l-glu-na)的合成有多篇文献(bioconjugate che m.,1992,3,295-301；cancer research 63,8977-8983,2003；journal of controll edrelease 101(2005)223-232；j biomed.eng.,2006,23(4),786-789；nature nanotechnology,2011,166等)进行了报道，合成方法是l-谷氨酸-γ-苄酯环内酸酐(blg-nca)以甲氧基聚乙二醇胺(mpeg-nh2)为引发剂，室温下聚合得到甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸-γ-苄酯)(mpeg-pblg)，然后进行碱解脱掉谷氨酸单元的γ位苄基得到甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸钠)(mpeg-p(l-gl u-na))，反应式如下：

7、

8、上述第一步聚合反应常用的反应溶剂有二氯甲烷、氯仿、二氧六环、甲苯、 n,n-二甲基甲酰胺等，得到的嵌段共聚物mpeg-pblg的分子量分布系数(p di)一般在1.2以下，但第二步碱解脱苄反应容易引起聚合物的分子量分布变宽、纯度降低，得到的mpeg-p(l-glu-na)达不到用于制备纳米胶束药物的载体的要求；文献报道的碱解反应所用氢氧化钠水溶液的浓度有1mol/l、0.5mol /l，在采用高浓度氢氧化钠水溶液(大于0.5mol/l)时，聚谷氨酸片段的酰胺键容易发生碱解，引起聚合物链的断裂，而当采用低浓度的氢氧化钠水溶液(低于或等于0.5mol/l)时，聚谷氨酸片段上的苄基残留较多，难以脱除干净，所以碱解脱苄基方式制约着mpeg-p(l-glu-na)的纯度和分子量分布情况。

9、中科院长春应化所的陈学思院士团队(macromol biosci.2012,12,1514-15 23)报道采用33％的溴化氢醋酸溶液来代替氢氧化钠水溶液进行脱苄基反应，克服了碱解条件下聚谷氨酸长链断裂和苄基残留问题，但33％的溴化氢醋酸溶液腐蚀性太强，污染太重，在大生产中难以广泛应用，并且强酸性条件不可避免对聚乙二醇链的聚醚建有破坏作用。文献(colloids and surfaces b:biointer faces 113(2014),230-236)报道在三氟醋酸中用三氟甲磺酸进行脱苄酯，仍旧采用的是强酸性条件；而采用常规的钯碳催化氢解脱掉苄酯时，钯碳会包裹进聚合物中难以除去，引起重金属残留。

10、此外目前文献报道的mpeg-p(l-glu-na)纯化方式皆是简单的萃取或用透析袋进行纯化，难以有效除去无机盐和小分子杂质，所得聚合物载体的各项质量指标不能得到保证，也难以进行大规模的生产放大。

11、综上所述，mpeg-p(l-glu-na)合成路线中苄酯水解的方法选择至关重要，不恰当的脱苄方式容易引起聚合物链的断裂，引起分子量分布变宽和杂质的产生，而mpeg-p(l-glu-na)的纯度和分子量分布情况影响着其作为载体所制备的聚合物胶束的药效，因此开发出一种操作简单、绿色环保、适合工业化生产的适当有效的脱苄基方法和聚合物载体的纯化方式具有重要意义。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，提供了一种高纯度窄分子量分布的甲氧基聚乙二醇- 聚(l-谷氨酸钠)的制备方法和应用，该方法操作简便、绿色环保，有效避免聚合物长链的酰胺键和醚键水解断裂，分子量高，并且纯度高，满足质量指标，适合工业化生产。

2、根据本技术的一个方面，提供了一种高纯度窄分子量分布的甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸钠)的制备方法，合成路线如下：

3、

4、其中，n为20～500中的任意整数，m为10～60中的任意整数；

5、包括以下步骤：

6、(1)将甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸-γ-苄酯)溶解到有机溶剂中，加入 0.1mol/l的氢氧化钠水溶液和15-冠醚-5，搅拌反应；

7、(2)监控步骤(1)反应液中苯甲醇含量的变化来确定碱解反应终点，当反应液中苯甲醇含量逐渐升高至保持不变达到理论含量时即为反应终点，用酸调ph至6～8，搅拌后再减压浓缩除掉挥发性有机溶剂；

8、(3)将步骤(2)得到的反应液用切向流超滤系统纯化除去无机盐和小分子化合物，所得水溶液进行冻干得到甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸钠)。

9、其中，步骤(2)苯甲醇理论含量的计算方法为：(反应液中苄酯的摩尔数 *苯甲醇的分子量)/反应液体积。

10、可选地，有机溶剂为乙腈、四氢呋喃和n,n-二甲基甲酰胺中的一种或多种。

11、可选地，甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸-γ-苄酯)与有机溶剂的重量比为 1:(1～10)。

12、可选地，甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸-γ-苄酯)中的苄酯数与氢氧化钠、 15-冠醚-5的摩尔比为1:(1.0～2.5):(0.05～0.2)。

13、可选地，步骤(2)中酸为盐酸、硝酸、硫酸、甲酸、乙酸和柠檬酸中的任意一种。

14、可选地，步骤(2)中酸为质量分数10％的硫酸。

15、可选地，步骤(1)中反应时间为24-48h，步骤(2)中搅拌时间为15min，步骤(1)和步骤(2)中反应温度均为室温25℃。

16、可选地，步骤(2)中每隔2h使用高效液相色谱法检测苯甲醇含量。

17、优选地，mpeg片段的n为20～500，包括数均分子量(mn)为1000da、 2000da、5000da、10kda、12kda、15kda、20kda。

18、可选地，步骤(3)中切向流膜包的截留分子量与甲氧基聚乙二醇-聚(l- 谷氨酸钠)的分子量比例为(0.1～0.8):1；步骤(3)中冻干温度为-40-20℃，冻干时间为48-72h。

19、根据本技术的另一个方面，还提供了一种上述制备方法制备得到的高纯度窄分子量分布的甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸钠)的应用，其用于聚合物胶束纳米药物载体，hplc纯度100％，gpc聚合物分散系数小于1.1。

20、本技术中的“室温”是指25℃。

21、本技术的有益效果包括但不限于：

22、1.根据本技术的高纯度窄分子量分布的甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸钠) 的制备方法，通过使用0.1mol/l氢氧化钠水溶液和15-冠醚-5的组合对 mpeg-pblg进行苄酯碱解反应，不仅使得碱解反应能完全脱除苄基，而且有效避免了共聚物长链的酰胺键和醚键被破坏，15-冠醚-5与聚合物的pblg链发生缔合作用，对苄酯的碱性水解有导向催化作用；

23、mpeg-pblg的空间结构是环状结构，其中疏水基团苄酯处于环的内侧，采用低浓度的氢氧化钠水溶液进行碱解反应时，环内侧的苄酯无法有效进行反应，当采用高浓度的氢氧化钠水溶液进行碱解反应时，氢氧离子优先破坏聚合物的环状结构，即组成聚合物链的酰胺键，然后再对苄酯进行碱解脱除反应；本技术通过采用0.1mol/l氢氧化钠水溶液和15-冠醚-5的组合对此共聚物进行苄酯水解反应，不仅仅是络合钠离子增强氢氧化钠水溶液的碱性，更重要的是使15-冠醚-5与pblg链发生缔合作用，催化聚合物环内侧的苄酯进行碱水解，避免了聚合物长链的酰胺键和醚键的水解断裂，增强了苄酯的水解脱除能力，提高了产品的纯度和分子量分布情况。

24、2.根据本技术的高纯度窄分子量分布的甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸钠) 的制备方法，避免了酸性脱苄酯方法中强酸性、腐蚀性试剂的使用，易于进行放大操作，将mpeg-p(l-glu-na)的合成推进到可以进行大规模生产的阶段。

25、3.根据本技术的高纯度窄分子量分布的甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸钠) 的制备方法，通过采用切向流超滤系统进行产品的纯化，可以有效除去小分子杂质和无机盐类，使聚合物载体的各项质量指标得到保障，利于工业化大规模生产。

26、4.根据本技术的高纯度窄分子量分布的甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸钠) 的制备方法，通过限定甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸-γ-苄酯)与有机溶剂的重量比，避免了起始物料由于浓度过高引起的反应放热而导致的副反应发生，使得苄酯碱解脱除反应可以稳定高效地进行，同时也避免了起始物料低浓度时引起的有机溶剂浪费，具有良好的经济效益。

27、5.根据本技术的高纯度窄分子量分布的甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸钠) 的制备方法，通过限定甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸-γ-苄酯)中的苄酯数与氢氧化钠、15-冠醚-5的摩尔比范围，使得苄酯碱解反应完全，同时避免了聚合物链中的酰胺键发生水解断裂。

28、6.根据本技术的高纯度窄分子量分布的甲氧基聚乙二醇-聚(l-谷氨酸钠) 的制备方法，通过限定酸的种类和质量分数，使得在后面的纯化过程中较好的保持聚合物水溶液的稳定性，避免因酸引起的副反应的发生。