LncRNAIFA吸附miR-26a在猪卵巢颗粒细胞中的应用

本发明属于细胞工程和基因工程，具体涉及lncrna ifa吸附mir-26a在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

背景技术：

1、lncrna通常指长度超过200个核苷酸连接的内源性细胞rna分子，具有与mrna类似的结构，但不具备蛋白编码的能力，然而大量的研究早已表明，lncrna并非都是转录噪音，许多lncrna通过不同的机制，在包括机体发育、疾病等过程中均发挥着极其重要的生物学功能。lncrna作为竞争性内源rna(cerna)与mrna竞争吸附mirna从而促进mrna的表达，是lncrna经典的生物学作用模式。

2、lncrna ifa(inhibitor of follicular atresia，暂命名)为针对猪卵巢颗粒细胞进行rna-seq所获得的lncrna。lncrna ifa可以抑制卵巢颗粒细胞的凋亡、促进卵巢颗粒细胞的增殖与细胞周期进程，并增强卵巢颗粒细胞的细胞活性。

3、micrornas(mirnas)是一种内源性的非编码rna，长度通常为23个核苷酸连接，mirna最常见的生物学作用模式是通过与蛋白质编码基因的mrna配对从而对基因发挥转录后的抑制效果，从而调控基因的表达。

4、mir-26a作为一种mirna，在不同种类的细胞中均有着重要的生物学功能，目前已经有大量的研究表明mir-26a可以通过对基因的转录后调控进而影响细胞的凋亡、分化、增殖及迁移等。研究显示，mir-26a可以通过靶向hmga1基因，促进肺癌肿瘤的进展；在肉骨瘤和膀胱癌细胞中，mir-26a呈现低表达，并抑制细胞的增殖、迁移与侵袭；在猪卵巢颗粒细胞中，mir-26a可以促进细胞凋亡、抑制细胞增殖与细胞周期进程，并降低细胞活性。

技术实现思路

1、为解决相关问题，本发明的首要目的在于提供一种调控猪卵巢颗粒细胞lncrnaifa表达的方法。

2、本发明的另一目的在于提供lncrna ifa吸附mir-26a在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

3、为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

4、一种调控猪卵巢颗粒细胞lncrna ifa表达的方法，体外环境下，mir-26a通过靶向lncrna ifa的rna分子从而负调控猪卵巢颗粒细胞中lncrna ifa的表达；通过调节mir-26a的表达水平，可实现猪卵巢颗粒细胞中lncrna ifa表达的调控；所述的lncrna ifa的核苷酸序列如seq id no：1所示。

5、进一步地，mir-26a可以与lncrna ifa的rna分子结合并调控其表达水平，mir-26a的表达水平升高，lncrna ifa表达量上升，mir-26a的表达水平降低，lncrna ifa表达量下降。

6、进一步地，mir-26a的表达水平升高通过mir-26a模拟物实现，采用的mir-26amimic是针对mir-26a成熟mirna设计并合成的小片段单链rna，所述小片段单链rna的序列与相应的mirna序列相同。所述过表达mir-26a时采用的mir-26a mimic的序列为：5’-uucaaguaauccaggauaggcu-3’(seq id no.4)。

7、进一步地，mir-26a的表达水平降低通过mir-26a核酸抑制物实现，采用的mir-26ainhibitor是针对mir-26a成熟mirna设计并合成的小片段单链rna，所述小片段单链rna的序列与相应的mirna序列反向互补。所述干扰mir-26a时采用的mir-26a inhibitor的序列为：5’-agccuauccuggauuacuugaa -3’(seq id no.5)。

8、lncrna ifa竞争性吸附mir-26a在猪卵巢颗粒细胞中的应用，体外环境的猪卵巢颗粒细胞中，由增加外源性lncrna ifa引起的促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进细胞活性、促进细胞周期进程中的任意一种或多种功能表型，能在增加外源性mir-26a后逆转。

9、进一步地，增加外源性lncrna ifa通过基因过表达技术实现，采用的基因过表达载体通过如下方式制备得到：

10、(1)提取猪卵巢颗粒细胞的rna，将其逆转录成cdna，以cdna为模板进行pcr扩增，得到目的片段；

11、(2)将目的片段连接到用限制性内切酶bamh i和xba i酶切后的pcdna3.1载体上，得到重组载体。

12、步骤(1)中进行pcr扩增所用引物如下所示：

13、lncrna ifa f：5’-ggcgatgcctgggtacatgg-3’；

14、lncrna ifa r：5’-gagaccgcgtccactccgcc-3’。

15、本发明所述lncrna ifa(inhibitor of follicular atresia，暂命名)为针对猪卵巢颗粒细胞进行rna-seq所获得的lncrna，其核苷酸序列如seq id no：1所示。

16、本发明前期通过基因工程和细胞工程技术，发现lncrna ifa可以促进卵巢颗粒细胞的增殖、抑制凋亡，同时增强卵巢颗粒细胞的细胞活性，加快卵巢颗粒细胞的细胞周期进程。具体为通过edu(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)实验证明，在体外环境下，过表达lncrnaifa可以促进卵巢颗粒细胞的增殖(p<0.01)，而干扰lncrna ifa则抑制卵巢颗粒细胞的增殖(p<0.05)；通过cck8(cell counting kit-8)实验证明，在体外环境下，过表达lncrnaifa后卵巢颗粒细胞的细胞活性显著增强(p<0.01)，而干扰lncrna ifa后卵巢颗粒细胞的细胞活性被显著抑制(p<0.01)；通过流式细胞术(flow cytometry，fcm)实验证明，在体外环境下，过表达lncrna ifa可显著抑制卵巢颗粒细胞的凋亡(p<0.01)，并加快卵巢颗粒细胞的细胞周期进程(p<0.05)，干扰lncrna ifa后，卵巢颗粒细胞凋亡率显著下降(p<0.001)，且细胞周期进程被显著抑制(p<0.01)。

17、本发明前期通过生物信息学手段，确定了lncrna ifa序列中存在的mir-26a结合位点。

18、本发明的验证结果如下：

19、1、本发明通过生物信息学手段预测到lncrna ifa序列中存在的mir-26a结合序列，预测结果显示lncrna ifa序列中存在一个mir-26a的结合位点(图1中a)。

20、2、本发明通过pull down实验检测到，lncrna ifa与mir-26a存在直接结合(图1中b)。

21、3、本发明通过双荧光素酶实验检测到，与转染pglo-ifa-wt+mimic nc组的细胞相比，pglo-ifa-wt+mir-26a mimic组的细胞相对荧光活性显著下降；而pglo-ifa-mut+mimicnc组与pglo-ifa-mut+mir-26a mimic组细胞的相对荧光活性无显著差异(图1中c)。

22、4、本发明通过qpcr检测到，在过表达mir-26a后，lncrna ifa的表达量显著下降，而干扰mir-26a后，lncrna ifa的表达量显著上升(图2)。

23、5、本发明通过cck8(cell counting kit-8)实验证明，在体外环境下，过表达lncrna ifa后卵巢颗粒细胞的细胞活性显著增强；而同时过表达lncrna ifa与mir-26a后卵巢颗粒细胞的细胞活性又出现了显著下降(图4中c)。

24、6、本发明通过流式细胞术(flow cytometry，fcm)实验证明，在体外环境下，过表达lncrna ifa可显著抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，并加快卵巢颗粒细胞的细胞周期进程；而同时过表达lncrna ifa与mir-26a后卵巢颗粒细胞的凋亡比例出现回升，细胞周期进程被再次阻滞(图3)。

25、7、本发明通过edu(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)实验证明，在体外环境下，过表达lncrna ifa后卵巢颗粒细胞的增殖率显著升高；而同时过表达lncrna ifa与mir-26a后卵巢颗粒细胞的增殖率又出现了显著下降(图4中b)。

26、本发明以lncrna ifa与mir-26a为研究对象，采用分子细胞生物学的方法，首先验证了lncrna ifa与mir-26a的直接结合；随后检测了mir-26a对lncrna ifa表达量的调控，证明了mir-26a对lncrna ifa的表达量存在负调控；最后研究了lncrna ifa与mir-26a对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡、活性及周期的影响，证实了mir-26a可以逆转lncrna ifa对卵巢颗粒细胞的凋亡与增殖、周期、活性的影响。

27、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

28、本发明通过生物信息学与分子生物学实验预测并验证了lncrna ifa序列中存在的mir-26a结合位点；在过表达或干扰mir-26a后检测了lncrna ifa的表达量；在过表达lncrna ifa及mir-26a后检测了卵巢颗粒细胞的细胞活性、增殖和凋亡水平、细胞周期进程的变化，为卵巢颗粒细胞的增殖凋亡调控机制研究积累了材料。本研究的发明结果显示，lncrna ifa可以通过竞争性吸附mir-26a，发挥其促进卵巢颗粒细胞增殖、抑制卵巢颗粒细胞凋亡、加快卵巢颗粒细胞的细胞周期进程，同时提高卵巢颗粒细胞活性的生物学功能。