一种高效降解氯霉素的解鸟氨酸拉乌尔菌、菌剂及其应用

1.本发明涉及生化环境治理领域，具体的说是一种高效降解氯霉素的解鸟氨酸拉乌尔菌、菌剂及其应用。


背景技术：

2.抗生素是由微生物通过二次代谢自然合成或者从工业中人工合成的有机物，能抑制其他微生物的生长或代谢活性，具有使用广泛、机体利用率低、降解周期长的特点。全球每年使用10～20万吨抗生素，而由于我国人口众多，抗生素的使用量一直处于世界领先地位，每年使用量超过2.5万吨，这导致在不同的水环境如地表水、地下水和污水处理厂中出现了抗生素，这些抗生素不仅是水资源循环使用的一个巨大挑战，也引起了日益严重的生态污染问题。氯霉素是一种广谱抗生素，水中残留的氯霉素不仅会直接对动物和人体造成损伤，而且会导致致病菌的耐药性，从而对人类的身体健康和环境造成巨大威胁。
3.目前，氯霉素废水的处理主要利用生物电化学系统还原降解、射线辐射降解和臭氧氧化降解等，但由于氯霉素稳定的化学性质导致单一的物理或化学方法难以将水体中的氯霉素完全去除。与物理和化学法相比，微生物降解法具有绿色、成本低、环境友好等优点。目前，国内外关于氯霉素降解菌的筛选和特性的研究日渐增多。研究表明以污泥作为菌源，驯化筛选出的氯霉素降解混合菌降解效果好，在氯霉素浓度为200mg/l时，72h的氯霉素降解率为99.69％，但是其混合菌中的单一菌种不具备降解能力；从鱼塘沉淀物筛选到的氯霉素降解菌，在氯霉素浓度为100mg/l时，7d好氧混合菌csfo的降解率只有28.96％，csfo-3纯菌株7d内降解率有30.01％；从河水中筛选到的氯霉素降解菌，在氯霉素浓度为50μg/l时，恶臭假单胞菌对氯霉素的去除率高达89.54％，而嗜水气单胞菌对氯霉素的去除率只有13.79％。由此可见，现有技术中缺少单一的高效氯霉素降解菌，导致废水中的氯霉素降解处理时降解菌的调制工艺繁琐，降解成本过高。


技术实现要素：

4.本发明旨在提供一种高效降解氯霉素的解鸟氨酸拉乌尔菌、菌剂及其应用，通过单一降解菌高效降解废水中的氯霉素。
5.为了解决以上技术问题，本发明采用的具体方案为：氯霉素高效降解菌，该菌为解鸟氨酸拉乌尔菌(raoultella ornithinolytica sp.cc12)，2022年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25321。
6.优选的，该菌的16s rrna基因序列已提交genbank数据库，登录号为mw521137。
7.优选的，该菌的菌落呈圆形、米白色、质地湿润，细胞呈粗杆状，革兰氏染色阴性。
8.优选的，该菌分离于处理氯霉素废水的多级生物接触氧化反应器内活性污泥。
9.氯霉素高效降解菌剂，通过以下方法制作：
10.将氯霉素高效降解菌接种于已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行振荡培养，培养条件为温度28-32℃，装液量90-110/250ml，培养时间：12-24h；培养结束后的培养液即
为氯霉素高效降解菌剂。
11.优选的，牛肉膏蛋白胨液体培养基组成为：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl 5g/l，蒸馏水1000ml，ph值7-8。
12.氯霉素高效降解菌剂在污水中氯霉素降解中的应用。
13.优选的，应用条件为：将权利要求5所述的氯霉素高效降解菌剂按照1-20％的接种量投入氯霉素含量为100-300mg/l的废水中，在ph值为5-9、温度为20-40℃条件下进行废水中氯霉素的降解。
14.优选的，应用条件为：将权利要求5所述的氯霉素高效降解菌剂按照5％的接种量投入氯霉素含量为300mg/l的废水中，在ph值为7、温度为30℃条件下进行废水中氯霉素的降解。有益效果
15.本发明提供了一种氯霉素高效降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12，利用其制备的微生物菌剂能将300mg/l氯霉素降解91％以上。为氯霉素废水的处理提供了丰富的微生物资源，对环境保护和水资源利用具有重要意义。
16.本发明中的raoultella ornithinolytica sp.cc12为氯霉素降解的单一降解菌，制作简单、使用方便且高效，适于推广应用。
附图说明
17.图1为菌株raoultella ornithinolytica sp.cc12的菌落形态图；
18.图2为菌株raoultella ornithinolytica sp.cc12的菌体透射电镜图；
19.图3为菌株raoultella ornithinolytica sp.cc12基于16s rrna基因序列构建的系统发育树；
20.图4为不同氯霉素浓度对菌株raoultella ornithinolytica sp.cc12降解氯霉素的影响示意图；
21.图5为不同接种量对菌株raoultella ornithinolytica sp.cc12降解氯霉素的影响示意图；
22.图6为不同ph值值对菌株raoultella ornithinolytica sp.cc12降解氯霉素的影响示意图；
23.图7为不同温度对菌株raoultella ornithinolytica sp.cc12降解氯霉素的影响示意图。
具体实施方式
24.以下通过：(一).高效氯霉素降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12的分离和鉴定、(二).高效氯霉素降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12的降解菌剂的制备、(三).高效氯霉素降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12的降解菌剂的氯霉素降解最佳效率的实验论证、(四).高效氯霉素降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12的降解菌剂在含氯霉素废水中的氯霉素降解的实际应用，共四个部分对本发明的技术方案进行说明。(一).高效氯霉素降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12的分离和鉴定：
25.菌株来源：多级生物接触氧化反应器处理氯霉素废水系统最终阶段填料上的活性污泥。
26.分离过程：1)初筛：称取10g上述活性污泥于90ml筛选培养基中，30℃、120r/min振荡培养2d，静置1h。吸取上层悬浮液依次梯度稀释成10-1-10-8
的菌悬液。分别吸取0.1ml菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，30℃培养2-3d，以不接菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基为空白对照，共初筛得到6株细菌。
27.其中，筛选培养基组成为：三水乙酸钠1.914g/l，葡萄糖0.281g/l，nh4cl0.229g/l，k2hpo
4 0.067g/l，mgso4·
7h2o 0.049g/l，cacl
3 0.023g/l，微量元素1ml/l(h3bo
3 0.11g/l，cuso4·
5h2o 0.22g/l，fecl3·
6h2o 0.24g/l，mncl4·
h2o 0.20g/l，znso4·
7h2o 0.10g/l，namoo4·
2h2o 0.11g/l，cocl2·
6h2o 0.20g/l)，ph值为7.5，115℃灭菌20min。牛肉膏蛋白胨固体培养基组成为：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl 5g/l，蒸馏水1000ml，琼脂粉13.5g/l，ph值为7.0-7.2，高压121℃灭菌20min。
28.2)复筛：分别挑取适量上述6株初筛得到的细菌的菌落，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、120r/min培养12h-24h，5 000r/min，离心5min，取上清，无菌蒸馏水重悬3次。od
600
值调节至0.5，分别以5％接种量接种到含有50mg/l氯霉素的筛选培养基中，30℃、120r/min振荡培养12h时。
29.其中牛肉膏蛋白胨液体培养基组成为：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，蒸馏水1000ml，ph值7-8，121℃灭菌20min。筛选培养基同步骤上述步骤1)。
30.3)氯霉素浓度的测定：
31.分别收集步骤2)中的筛选培养基中的菌液，8000rpm离心10min，取适量上清液用0.22μm滤膜过滤，高效液相色谱法测定上清液中氯霉素浓度：c18色谱柱，柱温30℃，流动相比例为甲醇：水＝65：35，流速为1ml/min，进样量10μl，检测波长278nm。
32.在上述条件下，测量上清液中的氯霉素残留量，计算得到氯霉素降解率，选取对于氯霉素降解率最高的菌株cc12，该菌株对于氯霉素的降解率大约为93％左右。
33.4)细菌的系统发育分析：
34.复筛得到降解效果最佳的菌株cc12利用碱裂解法制备其dna模板，采用细菌通用引物1492r(5
′‑
ctacggctaccttgttacga-3
′
)和27f(5
′‑
gagagtttgatcctggctcag-3
′
)分别对其进行16s rrna基因pcr扩增，将pcr产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，获得菌株cc12的16s rrna的基因序列长度为1440bp。将获得的16s rrna基因序列在核苷酸标准库及ezbiocloud数据库中进行在线blast对比分析，结果表明菌株cc12与raoultella ornithinolytica具有99.23％的相似性，结合形态和生理学特性，判断该菌为raoultella属，故将其命名为raoultella ornithinolytica sp.cc12。raoultella ornithinolytica sp.cc12的理化特性如图1-3所示。(二).高效氯霉素降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12的降解菌剂的制备：
35.1)、将新鲜的raoultella ornithinolytica sp.cc12接种于已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中120r/min振荡培养12-24h，培养温度30℃，装液量100ml/250ml。牛肉膏蛋白胨液体培养基组成为：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl 5g/l，蒸馏水1000ml，ph值7-8，121℃灭菌20min。
36.2)、培养发酵结束后，培养液罐装成菌剂，即制得高效氯霉素降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12的降解菌剂。(三).高效氯霉素降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12的降解菌剂的氯霉素降解最佳效率的实验论证：
37.1)不同氯霉素浓度对菌株raoultella ornithinolytica sp.cc12的降解菌剂的降解氯霉素的影响：
38.将上述利用高效氯霉素降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12制备好的微生物菌剂以5％接种量(w/w)接种于含有不同氯霉素浓度：50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l和300mg/l的筛选培养基中，在120r/min、30℃的摇床里培养。分别于6h、12h、24h、48h时用高效液相色谱法测定上清液中的氯霉素含量。如图4所示，当氯霉素含量低于300mg/l时，在12h时该高效微生物菌剂对氯霉素的降解率已达到86％以上；24h，该高效微生物菌剂对300mg/l氯霉素的降解率提高至94％。
39.2)不同接种量对菌株raoultella ornithinolytica sp.cc12降解氯霉素的影响：
40.将上述利用高效氯霉素降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12制备好的微生物菌剂，分别以1％、5％、10％、15％、20％接种量接种于含有300mg/l氯霉素的筛选培养基中，在120r/min、30℃的摇床里培养。12h时用高效液相色谱法测定上清液中的氯霉素含量。如图5所示，当高效氯霉素降解菌剂的接种量为5％时，其对氯霉素(300mg/l)的降解率较高，达到93％左右。
41.3)不同ph值对菌株raoultella ornithinolytica sp.cc12降解氯霉素的影响：
42.将上述利用高效氯霉素降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12制备的微生物菌剂，以5％的接种量接种于含有300mg/l氯霉素的ph值值分别为5、6、7、8、9的筛选培养基中，在120r/min、30℃的摇床里培养。12h时用高效液相色谱法测定上清液中的氯霉素含量。如图6所示，当筛选培养基的ph值值为7时，该微生物菌剂对氯霉素的降解效果较好，达到94％左右。
43.4)不同温度对菌株raoultella ornithinolytica sp.cc12降解氯霉素的影响：
44.将上述利用高效氯霉素降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12制备好的微生物菌剂，以5％的接种量接种于含有300mg/l氯霉素的筛选培养基中，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的摇床里120r/min培养。12h时用高效液相色谱法测定上清液中的氯霉素含量。如图7所示，当培养温度为30℃，氯霉素降解率较高，达到98％左右。
45.综上，本发明的氯霉素高效降解菌剂在菌剂的接种量为5％，氯霉素废水的ph值值为7，氯霉素废水中的氯霉素含量为300mg/l、温度为30℃，发酵12h时达到最优，降解率高达93％-98％。(四).高效氯霉素降解菌raoultella ornithinolytica sp.cc12的降解菌剂在含氯霉素废水中的氯霉素降解的实际应用：
46.本部分包括两个实施例：实施例1
47.在序批间歇式活性污泥法(sbr)处理氯霉素废水中应用：采用sbr反应器(4l)处理氯霉素废水(氯霉素200mg/l，三水乙酸钠0.639g/l，葡萄糖0.093g/l，nh4cl 0.076g/l，k2hpo
4 0.022g/l，mgso4·
7h2o 0.049g/l，cacl
3 0.023g/l，1ml/l微量元素：h3bo
3 0.11g/
l，cuso4·
5h2o 0.22g/l，fecl3·
6h2o 0.24g/l，mncl4·
h2o 0.20g/l，znso4·
7h2o 0.10g/l，namoo4·
2h2o 0.11g/l，cocl2·
6h2o 0.20g/l)。sbr反应器接种城市污水处理厂活性污泥，污泥浓度(mlss)为4000mg/l，sbr分为进水期0.5h、反应期6h、沉淀期1h、排水排泥期0.5h，溶解氧维持在5-6mg/l，每天换水2l，在室温下连续运行30天。每7天以5％接种量(v/v)向sbr反应器内加入上述利用raoultella ornithinolytica sp.cc12制备的高效氯霉素降解菌剂，其对氯霉素的去除率高达94％，并对cod、po
43-、氨氮等去除具有明显的强化效果，其去除率都可达到90％以上。实施例2
48.在多级生物接触氧化反应器处理氯霉素废水中应用：多级生物接触氧化反应器的总有效容积为16l，通过3个5mm亚克力隔板将其分割成4个大小完全相同的氧化池，分别在奇数隔板的底部和偶数隔板的顶部设置溢流口(25mm
×
30mm)，相邻两个氧化池以隔板上的溢流口进行串联使水流上下蛇形流动。在每个氧化池内部均放置一个填料架，并绑扎聚酰胺填料构成填料单元。多级生物接触氧化反应器接种城市污水处理厂活性污泥，闷曝3～5天，使各个氧化池内的填料上均附着大量泥黄色的生物膜，即挂膜成功。驯化结束后，开始进水：氯霉素废水(氯霉素300mg/l，三水乙酸钠0.639g/l，nh4cl 0.076g/l，k2hpo
4 0.022g/l，mgso4·
7h2o 0.049g/l，cacl
3 0.023g/l，1ml/l微量元素：h3bo
3 0.11g/l，cuso4·
5h2o 0.22g/l，fecl3·
6h2o 0.24g/l，mncl4·
h2o 0.20g/l，znso4·
7h2o 0.10g/l，namoo4·
2h2o 0.11g/l，cocl2·
6h2o 0.20g/l)。水力停留时间为24h，在室温下连续运行65天。每5天以5％接种量(v/v)向多级生物接触氧化反应器内加入0上述利用raoultella ornithinolytica sp.cc12制备的高效氯霉素降解菌剂。经过65天的正常运行，其对氯霉素的去除率高达93％，并对cod、po
43-、氨氮等去除率分别为91％、92％和84％。