具有诱导血小板聚集活性的丫蕊花皂苷G及其制备方法和用途

具有诱导血小板聚集活性的丫蕊花皂苷g及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明属于植物化学和药物领域，具体而言，涉及一种具有诱导血小板聚集活性的丫蕊花皂苷g(ypsilandroside g)，含有该化合物的药物组合物，该化合物在制备用于治疗出血性疾病的药物或功能性日化品中的用途，以及该化合物的制备方法。


背景技术：

2.目前临床常用的止血药物很多，止血机制也很复杂，对止血药物的研究一直是个热门话题。出血诱因较多，某些疾病并发症也多伴随出血，故在应用止血药同时需要对症治疗，根据不同的出血原因、出血症状及止血药作用机制选择相应止血药物。凝血为多系统参与的复杂过程，内源性、外源性凝血途径及纤溶系统均参与该过程。血管收缩性能、血小板、血液黏稠度、凝血因子及纤溶等因素均影响止血过程。而止血药或促凝血药是能促进血液凝固而使出血停止的药物，其临床应用广泛，同时有着重要的临床价值。
3.传统中药和药用植物来源的天然化合物具有毒性较低、来源广泛等特点，在止血方面有着独特的优势和巨大的潜力。因此，从药用植物(或中药)中发现具止血作用的化合物是研发止血药或促凝血药的重要途径之一。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有诱导血小板聚集活性的丫蕊花皂苷g，为研发用于治疗出血性疾病的药物以及功能性日化品提供可行选项。
5.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
6.在第一方面，本发明提供了一种具有诱导血小板聚集活性的丫蕊花皂苷g，其具有下文式i所示的结构式。
[0007][0008]
在第二方面，本发明提供了一种用于治疗或预防出血性疾病的药物组合物，包含作为活性药物成分的上文式i所示的丫蕊花皂苷g化合物或其药学上可接受的前药、衍生物，以及药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂。
[0009]
在第三方面，本发明涉及上文所述丫蕊花皂苷g或其药学上可接受的前药、衍生物
在制备用于治疗或预防出血性疾病的药物中的用途。
[0010]
在第四方面，本发明涉及上文所述丫蕊花皂苷g或其药学上可接受的前药、衍生物在制备治疗、预防或防止出血性疾病的功能性日化品中的用途。
[0011]
在第五方面，本发明提供了制备上文所述丫蕊花皂苷g的方法，包括以下步骤：
[0012]
1)将丫蕊花属(ypsilandra)植物材料干燥粉碎，采用有机溶剂浸提后脱溶，得到丫蕊花属植物提取物；和
[0013]
2)对丫蕊花属植物提取物依次进行萃取、柱层析，得到丫蕊花皂苷 g。
[0014]
在优选实施方案中，有机溶剂为石油醚、正己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、异丙醇、乙腈、水和甲酸中的至少一种。
[0015]
现有技术中未有丫蕊花皂苷g(ypsilandroside g)在制备治疗出血性疾病药物以及制备功能性日化品中应用的报道。本发明对丫蕊花皂苷g 进行了体外对黑山羊(capra hircus)血小板聚集的活性实验，发现该化合物能显著诱导黑山羊血小板聚集，具有止血功效，在100μm时，最大血小板聚集率(maximal platelet aggregation rates,mpar)为55.00
±
3.61％。进一步的研究表明，其ec
50
值为57.17μm。经过多次药理试验研究表明，丫蕊花皂苷g具有显著的诱导血小板聚聚活性，从而具有止血功效。因此，本发明的丫蕊花皂苷g为研发用于治疗或预防出血性疾病的药物以及功能性日化品提供了可靠选项。
附图说明
[0016]
图1为本发明丫蕊花皂苷g的结构示意图。
[0017]
图2为丫蕊花皂苷g诱导血小板聚集的ec
50
曲线
具体实施方式
[0018]
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的优选实施方案。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方案。相反，提供这些实施方案的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
[0019]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所用的术语只是为了描述具体的实施方案的目的，并非旨在限制本发明的范围。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0020]
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种具有诱导血小板聚集活性的丫蕊花皂苷g，其结构式如下式i所示。
[0021][0022]
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种用于治疗或预防出血性疾病的药物组合物，包含作为活性药物成分的丫蕊花皂苷g或其药学上可接受的前药、衍生物，以及药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂。
[0023]
本领域技术人员应当理解，本发明的丫蕊花皂苷g的药学上可接受的衍生物，例如丫蕊花皂苷g的盐、酯、溶剂合物或水合物也可以用于本发明的药物组合物中。
[0024]
合适的药物赋形剂是本领域技术人员众所周知的。药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂，包括但不仅限于填充剂(稀释剂)、润滑剂(助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等。粘合剂包括糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物(如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素等)、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂包括乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、沉降碳酸钙等)、山梨醇或甘氨酸等；润滑剂包括微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油、聚乙二醇等；崩解剂包含淀粉及其衍生物(如羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉等)、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素等；湿润剂包括十二烷基硫酸钠、水或醇等；抗氧剂包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酸等；抑菌剂包括0.5％苯酚、0.3％甲酚、 0.5％三氯叔丁醇等；乳化剂包括聚山梨酯-80、没酸山梨坦、卵磷酯、豆磷脂等；增溶剂包括吐温-80、胆汁、甘油等。
[0025]
本发明的丫蕊花皂苷g或其药学上可接受的前药、衍生物用作药物时，可以直接施用，或者以药物组合物的形式施用。在本发明的药物组合物中，按药物组合物总重量计，药物组合物可以含有0.1
–
99％，优选为 0.5
–
90％的丫蕊花皂苷g或其衍生物。
[0026]
丫蕊花皂苷g或其药学上可接受的前药、衍生物的治疗有效量是指，在不对接受者造成明显负面或不利副作用的情况下，足以实现所需生物学效果例如诱导血小板聚集从而达到止血效果的丫蕊花皂苷g的量。应当理解，有效剂量会取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重。通常，有效量由施用治疗的人例如治疗医师来决定。
[0027]
在本发明的实施方案中，丫蕊花皂苷g在体外能显著诱导黑山羊血小板聚集，具有止血功效，在100μm时，最大血小板聚集率(mpar)为 55.00
±
3.61％。进一步的研究表明其ec
50
值为57.17μm。
[0028]
本发明的药物组合物可以以单位体重服用量的形式施用。所有以丫蕊花皂苷g或其药学上可接受的前药、衍生物为有效成分的药物组合物可以采用制药和食品领域公认的
方法制备成各种剂型，例如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂等)、喷剂、气雾剂等。本发明的药物组合物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)、口服、舌下给药、粘膜透析等途径给药，以治疗出血性疾病。
[0029]
根据本发明的第三方面，本发明提供了丫蕊花皂苷g或其药学上可接受的前药、衍生物在制备用于治疗或预防出血性疾病的药物或药物组合物中的用途。
[0030]
根据本发明的第四方面，本发明提供了丫蕊花皂苷g或其衍生物在制备治疗、预防或防止出血性疾病的功能性日化品中的用途。在具体实施方案中，功能性日化品可以为例如化妆品、洗护用品，例如洗发水、香皂、药皂、牙膏、漱口水、口腔清爽剂、沐浴液、洗面奶、洗手液、护手霜、剃须膏、脱毛膏、花露水等，但不限于此。
[0031]
在发明的实施方案中，出血性疾病包括出血状况或现象，或者出血性疾病，这是本领域技术人员公知的。出血状况或现象可以为组织受损后血液由创伤或天然孔流到体外导致的外出血，或者血管受损出血后血液积聚在组织内或腔体(例如胸腔、腹腔、关节腔)等处导致的内出血。出血性疾病可以为血管因素异常、血小板异常或者凝血因子异常导致的出血，例如子宫出血(例如失调性子宫出血)、口腔出血、牙龈出血、黏膜出血等，但不限于此。
[0032]
根据本发明的第五方面，本发明提供了制备上文所述丫蕊花皂苷g 的方法，包括以下步骤：
[0033]
1)将丫蕊花属植物材料干燥粉碎，采用有机溶剂浸提后脱溶，得到丫蕊花属植物提取物；和
[0034]
2)对所述丫蕊花属植物提取物依次进行萃取、柱层析，得到丫蕊花皂苷g。
[0035]
在本发明的实施方案中，丫蕊花属植物材料是黑药花科 (melanthiaceae)丫蕊花属植物中的丫蕊花(y.thibetica franch.)、小果丫蕊花(y.cavaleriei levl.et vnt.)、云南丫蕊花(y.yunnanensis w.w.sm.et j.f. jeffr.)、高山丫蕊花(y.alpina f.t.wang&t.tang)中的至少一种。在本发明的优选实施方案中，丫蕊花属植物材料为丫蕊花或小果丫蕊花。
[0036]
在本发明的具体实施方案中，丫蕊花属植物材料可以是根茎、地上部分或全草。对于新鲜的丫蕊花属植物材料或者其水分含量较高，例如水分含量超过15％，可以先进行干燥，然后粉碎或者研磨，从而有利于提取。干燥、粉碎或者研磨可以通过本领域常规技术手段来进行，例如自然日晒干燥、烘箱加热干燥、粉碎机粉碎、研磨粉碎。在优选的实施方案中，丫蕊花属植物材料是丫蕊花干燥全草或小果丫蕊花干燥全草。
[0037]
在本发明的实施方案中，步骤1)中的有机溶剂可以包括石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈和甲酸中的至少一种；优选，有机溶剂为乙醇。
[0038]
在本发明的实施方案中，步骤2)中的萃取是指将浸膏分散于水，用有机溶剂萃取，有机溶剂可以包括石油醚、乙酸乙酯、正丁醇中的至少一种，优选，有机溶剂为正丁醇。
[0039]
在本发明的实施方案中，步骤2)中的柱层析包括正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析、mci gel chp20p柱层析、制备或半制备高效液相色谱(hplc)；优选，柱层析包括正相硅胶柱层析、反相rp-18 柱层析、mci gel chp20p柱层析、半制备高效液相色谱(hplc)。
[0040]
在本发明的实施方案中，步骤2)中的柱层析所用洗脱剂包括石油醚、正己烷、氯
1-4(甲醇:水＝60:40，v/v)；
[0054]
(8)将上述步骤中收集到的fr.d-1-2通过半制备高效液相色谱 (hplc)，以乙腈-水为流动相，采用梯度洗脱的方法(0～30分钟，乙腈浓度从20％～50％，v/v)进行制备可得到丫蕊花皂苷g。经过hplc分析丫蕊花皂苷g纯度为98％。
[0055]
丫蕊花皂苷g的物理常数和波谱数据：白色针晶(meoh)，mp 223-224℃；(c 0.73,pyridine)；fab-ms(negative ionmode):m/z1028[m]-(100),882[m-146(rha)]-(22),735[m-h-146(rha)-146 (rha)]-(5)；hresi-ms(negative ion mode):m/z 1027.5107[m-h]-(calcd. for c
44h70o16
1027.5113)；ir(kbr)max(cm-1
):3440,2934,2876(ch), 1707(c＝o),1633,1454,1377,1046,981,918,899,868(899918,for25r-spirosketal)。1h nmr(c5h5n,500mhz):δ
h 1.50(h-1a,m),0.88(h-1b, m),2.05(h-2a,m),1.70(h-2b,m),3.81(h-3,m),2.68(h-4a,m),2.40(h-4b, m),5.27(h-6,br s),1.86(h-7a,m),1.46(h-7b,m),1.82(h-8,m),1.29(h-9, m),2.54(h-11a,t,j＝14.1hz),2.30(h-11b,dd,j＝14.1,5.7hz),1.43 (h-14,m),2.11(h-15a,m),1.70(h-15b,m),4.45(h-16,m),2.76(h-17,m), 1.06(me-18,s),1.09(me-19,s),1.91(h-20,m),1.33(me-21,d,j＝6.9hz), 1.74(h
2-23,m),1.64m(h
2-24,m),1.63(h-25,m),3.58(h-26a,m),3.46 (h-26b,t,j＝10.4hz),0.68(me-27,d,j＝5.6hz),4.93(h-1
′
,d,j＝7.8hz), 4.38(h-2
′
,m),4.18(h-3
′
,m),4.21(h-4
′
,m),3.62(h-5
′
,m),4.21(h-6
′
a,m), 4.04(h-6
′
b,m),6.40(h-1
″
,brs),4.83(h-2
″
,m),4.61(h-3
″
,m),4.35(h-4
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, m),4.93(h-5
″
,m),1.75(me-6
″
,d,j＝6.2hz),5.83(h-1
″′
,br s),4.51 (h-2
″′
,m),4.55(h-3
″′
,m),4.43(h-4
″′
,m),4.92(h-5
″′
,m),1.58(me-6
″′
,d, j＝6.1hz),6.27(h-1
″″
,br s),4.90(h-2
″″
,m),4.52(h-3
″″
,m),4.29 (h-4
″″
,m),4.96(h-5
″″
,m),1.59(me-6
″″
,d,j＝6.1hz)；
13
c nmr(c5d5n, 125mhz):δ
c 37.0(c-1,t),29.9(c-2,t),77.7(c-3,d),38.8(c-4,t),140.6 (c-5,s),121.6(c-6,d),31.8(c-7,t),31.0(c-8,d),52.3(c-9,d),37.7(c-10, s),37.5(c-11,t),212.7(c-12,s),55.0(c-13,s),56.0(c-14,d),31.8(c-15,t), 79.7(c-16,d),54.0(c-17,d),15.8(c-18,q),18.9(c-19,q),42.6(c-20,d), 13.9(c-21,q),109.4(c-22,s),31.6(c-23,t),29.2(c-24,t),30.5(c-25,d), 67.0(c-26,t),17.3(c-27,q),100.3(c-1
′
,d),78.0(c-2
′
,d),77.7(c-3
′
,d), 77.8(c-4
′
,d),77.0(c-5
′
,d),61.2(c-6
′
,t),102.2(c-1
″
,d),72.5(c-2
″
,d), 72.9(c-3
″
,d),74.1(c-4
″
,d),69.6(c-5
″
,d),18.7(c-6
″
,q),102.2(c-1
″′
,d), 72.9(c-2
″′
,d),73.3(c-3
″′
,d),80.4(c-4
″′
,d),68.3(c-5
″′
,d),18.8(c-6
″′
,q), 103.3(c-1
″″
,d),72.7(c-2
″″
,d),72.9(c-3
″″
,d),74.0(c-4
″″
,d),70.4 (c-5
″″
,d),18.5(c-6
″″
,q)。
[0056]
实施例2：丫蕊花皂苷g的制备方法二
[0057]
在本实施例中，采用以下步骤制备丫蕊花皂苷g：
[0058]
(1)小果丫蕊花全草干燥粉碎后得到植物材料；
[0059]
(2)采用70％乙醇回流提取3次(每次2小时)，合并提取液，减压回收乙醇，得到小果丫蕊花提取物水溶液；
[0060]
(3)将小果丫蕊花提取物水溶液用正丁醇萃取，回收溶剂得到正丁醇萃取物；
[0061]
(4)将所述植物提取物采用正相硅胶柱层析(硅胶用量与提取物的质量比为5:1)，用氯仿-甲醇(20:1
→
15:1
→
10:1
→
7:1
→
5:1
→
1:1) 梯度洗脱，得到6个流份即：fr.a(氯仿:甲醇＝20:1，v/v)、fr.b(氯仿: 甲醇＝15:1，v/v)、fr.c(氯仿:甲醇＝10:1，v/v)、fr.d
(氯仿:甲醇＝7:1， v/v)、fr.e(氯仿:甲醇:水＝5:1，v/v)、fr.f(氯仿:甲醇:水＝1:1，v/v)；
[0062]
(5)将收集得到的fr.e部分采用mci gel chp20p柱层析脱色，以甲醇:水(8:2，v/v)洗脱，回收溶剂后获得fr.e的脱色部分。
[0063]
(6)将收集得到的fr.e脱色部分采用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇-水 (9:1:0
→
8:2:0.2
→
7:3:0.5)梯度洗脱，分段收集得到3个部分：fr.e-1(氯仿:甲醇:水＝9:1:0，v/v)、fr.e-2(氯仿:甲醇:水＝8:2:0.2，v/v)、fr.e-3(氯仿:甲醇:水＝7:3:0.5，v/v)；
[0064]
(7)将上述步骤中收集到的fr.e-3通过半制备高效液相色谱(hplc)，以乙腈-水为流动相，采用乙腈浓度从40％(v/v)等度制备可得到丫蕊花皂苷g。经过hplc分析丫蕊花皂苷g纯度为97％。
[0065]
实施例3：丫蕊花皂苷g的止血活性
[0066]
为了更好地说明本发明的药理活性试验结果和本发明的优异性，下面将用于本发明的化合物丫蕊花皂苷g诱导黑山羊血小板聚集活性试验来说明，但并不以此来限定本发明。
[0067]
昆明黑山羊颈部用乙醇消毒液擦拭后，用医用一次性采血针经颈静脉抽取血液(枸橼酸钠真空抗凝采血管，全血:枸橼酸钠为9:1)，轻轻颠倒采血管数次使血液和抗凝剂混合均匀。所得抗凝血离心(200g，10min)，收集上清液为富血小板血浆(prp)；剩余血液再次离心(2400g，10min)，收集上清液为贫血小板血浆(ppp)，以ppp调prp血小板计数为500
×ꢀ
109个/l(参考文献：k
ü
ster lj,filep j,jc.mechanism ofpaf-induced platelet aggregation in man.thromb.res.1986,43(4):425-33； born,g.v.r.aggregation ofblood platelets by adenosine diphosphate andits reversal.nature 1962,194:927
–
929；yinh,litvinov ri,vilaire g,zhu h, li w,caputo ga,moore dt,lear jd,weisel jw,degrado wf,bennett js. activation of plateletαiibβ3by an exogenous peptide corresponding to thetransmembrane domain ofαiib.j.biol.chem.2006,281:36732
–
41)。将带搅拌子的比色杯与不带搅拌子的比色杯分别置于血小板聚集仪预温孔， 37℃预温10min。向预温好的带搅拌子的比色杯中加入250μl prp，不带搅拌子的比色杯中加入250μl ppp，同时加入2.5μl溶解样品所用的溶媒。然后继续预温5min后，将两比色杯分别放入prp测试位和ppp 测试位。调整记录曲线的基线，向prp测试杯中加入诱导剂adp(10 μmol/ml)或受试药物丫蕊花皂苷g(100μmol/ml)，记录血小板聚集曲线并计算最大聚集率。
[0068]
表1.发明化合物丫蕊花皂苷g诱导黑山羊血小板聚集量效关系的实验结果
[0069][0070]
结果如表1所示。由表1可以出，该丫蕊花皂苷g在100μmol/ml 的浓度下，有明显诱导兔血小板聚集的作用，其最大血小板聚集率(mpar) 为55.00
±
3.61％，而阳性对照药adp在10μmol/ml的浓度下，其最大血小板聚集率(mpar)为54.67
±
3.51％，进一步的研究表明，其ec
50
值为57.17μm，丫蕊花皂苷g诱导血小板聚集的ec50曲线如图2所示。