一种以抑制TRIM54泛素化降解STAT2为靶点的抗病毒ADE药物筛选方法

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种以抑制trim54泛素化降解stat2为靶点的抗病毒ade药物筛选方法。

背景技术：

1、抗体依赖的增强效应(antibody-dependent enhancement，ade)是指由于接种疫苗或感染病毒后产生的中和能力弱或不具备中和能力的抗体与病毒颗粒形成复合物后不仅不阻断反而促进了病毒感染细胞并通过破坏干扰素信号通路致使病毒复制增加的现象。1973年halstead等科学家首先描述了在登革热感染中的ade现象，后来发现ade现象在许多黄病毒属的病毒感染中广泛存在，例如，乙型脑炎病毒、寨卡病毒和登革病毒均有引发ade的可能。在sars-cov-2的防治过程中ade效应也是需要面对的重要挑战。目前尚没有用于治疗ade的特效药上市，ade已成为病毒感染防治中的一大干扰。因此，对ade的机制进行探索以发现抑制ade的靶点对于病毒感染疾病的防治具有重要的意义。

2、信号转导与转录激活蛋白(signal transducers and activators oftranscription,stat)是一种能与dna结合的蛋白质独特家族，stat家族包括7个结构和功能相关的蛋白stat1、stat2、stat3、stat4、stat5a、stat5b及stat6，通常对各种细胞外的细胞因子和生长因子信号做出应答，是一类含有能与磷酸化酪氨酸结合的sh2信号分子。stat是核内转录因子，但在静息细胞中，stat存在于胞质中。其中，stat2分子被激活后转入细胞核与特异性dna结合，影响基因转录，参与细胞的生长、分化、生存和凋亡。目前多项研究表明，stat2基因缺失或过表达对肿瘤发生发展有着重要影响，与肿瘤血管生成、肿瘤增殖及肿瘤凋亡密切相关。

3、三方基序蛋白(tripartite motif，trim)家族的名称是由于其具有3个保守的结构域而得来。这三个结构域从n端到c端的顺序依次是ring结构域(ring domain)、1个或2个b-box结构域、一个卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain)，此外该家族还具有一个可变的c-末端。目前人类基因组已发现和鉴定近70个trim蛋白成员，并且其家族成员的功能越来越受到重视。研究表明trim家族的成员参与了细胞分化、增殖、发育、凋亡等许多重要的生物学过程。大多数trim具有e3泛素连接酶活性，且与多种生理过程有关，包括细胞增殖、dna修复、信号转导和转录，近年来大量研究发现trim与癌症的发生发展相关。

4、但目前未有关于将stat2与trim54的互作作为阻断ade效应靶标的相关报道。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种以抑制trim54泛素化降解stat2为靶点的抗病毒ade药物筛选方法，通过将trim54和stat2分别与第一荧光蛋白(fp1)和第二荧光蛋白(fp2)融合表达形成了fp1-trim54和fp2-stat2，转染细胞后通过流式细胞仪或酶标仪检测荧光共振转移(fret)的强度评价trim54和stat2的互作情况，筛选出特异性抑制ade的化合物

2、本发明的第一个目的是提供一种以抑制trim54泛素化降解stat2为靶点的抗病毒ade药物筛选方法，包括以下步骤：

3、s1、分别构建第一质粒和第二质粒，将第一质粒和第二质粒导入细胞中，检测fret信号；所述第一质粒和第二质粒上分别含有编码trim54的基因和编码stat2的基因，第一质粒和第二质粒上分别含有编码第一荧光蛋白的基因和编码第二荧光蛋白的基因，且所述第一荧光蛋白和第二荧光蛋白能够发生荧光共振能量转移；

4、s2、将待测化合物与步骤s1所述细胞共孵育，根据fret信号的变化筛选出抑制病毒ade效应的药物。

5、进一步地，所述编码trim54的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、进一步地，所述编码stat2的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

7、进一步地，筛选fret信号降低的待测化合物作为备选抗病毒ade效应药物。

8、进一步地，在本发明的一个实施例中，所述第一荧光蛋白为青色荧光蛋白cfp，第二荧光蛋白为黄色荧光蛋白yfp。

9、进一步地，进行药物筛选时，以导入第三质粒的细胞为阳性对照，其中，第三质粒上含有编码第一荧光蛋白的基因和编码第二荧光蛋白的基因。

10、进一步地，进行药物筛选时，以导入第四质粒和第五质粒的细胞为阴性对照，其中，第四质粒和第五质粒上分别含有编码第一荧光蛋白的基因和编码第二荧光蛋白的基因。

11、进一步地，通过流式细胞法或荧光酶标法检测fret信号。

12、进一步地，在本发明的一个实施例中，所述细胞为293t细胞。

13、本发明提供了一种抑制病毒ade效应的新靶点，所述靶点为trim54和stat2：

14、人单核-巨噬细胞主要表达三类活化型fcγrs：fcγria、fcγriia和fcγriiia。虽然有证据表明fcγriiia能够参与介导登革病毒ade，更多的证据支持fcγriia而非fcγria和fcγriiia是ade的关键受体。例如，分别在越南、古巴、巴基斯坦和墨西哥四国完成的研究表明，fcγriia多态性与登革病毒感染预后密切相关。近期来自多个实验室的证据进一步表明，fcγriia参与介导登革、寨卡及埃博拉病毒的ade。抗体的存在形式可能影响ade效应，比如抗体的岩藻糖修饰影响其与fcr的亲和力，二聚体形式的抗体较单体更容易诱导ade效应等。另外，fcγriia胞桨区的itam基序是介导病毒ade效应的关键结构域，而fcγriib中的itim基序则发挥保护作用。

15、申请人在研究中发现，免疫复合物通过膜表面fcγriia作用于人单核细胞会增强其对病毒的易感性，在此过程中trim54表达量显著升高，并且其可通过降解stat2抑制ifn-i信号通路，导致单核巨噬细胞对病毒易感性升高。干扰trim54表达可以显著地逆转ade效应，因此认为trim54和stat2的互作可能是免疫复合物诱导单核细胞对病毒敏感性的增强的一个环节，提示其可作为阻断ade效应的靶标。由于trim54非组成性表达，仅表达于免疫复合物作用的单核巨噬细胞，特异性干预trim54与stat2的互作不会带来细胞对ifn-i相关信号通路的广泛影响，具有较高的特异性。因此，筛选出靶向trim54/stat2互作并且抑制ade效应的小分子化合物，对有ade效应的病毒防治有重要的生物学意义。

16、本发明的第二个目的是提供一种抑制trim54和stat2相互作用的物质在制备抗病毒ade效应药物中的应用。

17、本发明的第三个目的是提供一种表征trim54和stat2相互作用的物质在抗病毒ade效应药物筛选中的应用。

18、本发明的第四个目的是提供baricitinib或rivaroxaban在制备抑制病毒ade效应药物中的应用。

19、进一步地，所述baricitinib或rivaroxaban用于阻断trim54和stat2相互作用。

20、本发明的第五个目的是提供一种抗病毒ade效应的药物，所述药物中包括baricitinib或rivaroxaban。

21、借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

22、本发明公开了一种抑制病毒ade效应的新靶点，并提供了抑制e3泛素连接酶trim54泛素化降解底物stat2为靶点的治疗ade的应用。本发明通过将研究对象trim54和stat2分别与第一荧光蛋白(fp1)和第二荧光蛋白(fp2)融合表达形成了fp1-trim54和fp2-stat2，转染细胞后通过流式细胞仪或酶标仪检测荧光共振转移(fret)的强度评价trim54和stat2的互作情况。通过这一平台大规模筛选获得特异性抑制trim54/stat2互作的小分子化合物。并进一步利用分子生物学验证小分子对trim54/stat2互作的抑制效应，最后验证化合物对ade效应的抑制作用，最终筛选出了一系列靶向trim54/stat2互作并且抑制ade效应的小分子化合物，对有ade效应的病毒防治有重要的生物学意义。

23、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。