一种球孢白僵菌及其应用

本发明涉及生物防治，具体涉及一种球孢白僵菌及其应用。

背景技术：

1、自2019年以来，草地贪夜蛾以迅猛的速度扩张，其主要以“玉米型”为主，对玉米造成了严重危害，同时还为害水稻、高粱和甘蔗等作物，对农业生产造成了巨大威胁，同时给农民收益带来严重损害。

2、化学杀虫剂和转基因抗虫(bt)作物的广泛使用，草地贪夜蛾对多种化学农药和bt毒蛋白产生了严重的抗药性，其非可持续性显现。相比之下，病毒、细菌和真菌等昆虫病原微生物和天敌昆虫具有持续控害的能力，所以在对草地贪夜蛾的防治中，昆虫病原微生物日益受到重视。昆虫病原真菌对环境条件要求比较苛刻，通常它的致病力与其自身的毒力、抗逆性、寄主虫态、生理状况和环境等因素有关。因此，本技术提供了一种新的球孢白僵菌(beauveria bassiana)，并进行改造，使其具有抗胁迫能力，并且生防效果优异。

技术实现思路

1、本发明将白僵菌自身基因bbmpd转化到从土壤中分离到的hmbb-1菌株中，并形成了过表达bbmpd基因的工程菌株hmbb-mpd1，所述的工程菌株hmbb-mpd1提高了其抗逆能力(包含紫外、氧化、高渗透压和热逆境)，并增强了其对草地贪夜蛾的防效。

2、本发明的第一方面，提供了一种球孢白僵菌(beauveria bassiana)hmbb-1。

3、所述的球孢白僵菌(beauveria bassiana)hmbb-1于2022年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.40253。

4、所述的球孢白僵菌(beauveria bassiana)hmbb-1的its序列如seq id no：9所示。

5、cctattgggtgacgcggagggtcattaccgagttttcaactccctaacccttctgtgaacctacctatcgttgcttcggcggactcgccccagcccggacgcggactggaccagcggcccgccggggacctcaaactcttgtattccagcatcttctgaatacgccgcaaggcaaaacaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggctctggcatcgatgaagaacgcagcgaaacgcgataagtaatgtgaattgcagaatccagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagcattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcgacctccccttgggggggtcggcgttggggaccggcagcacaccgccggccctgaaatggagtggcggcccgtccgcggcgacctctgcgcagtaatacagctcgcaccggaaccccgacgcggccacgccgtaaaacacccaacttctgaacgttgacctcgaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaaaagggaaagaaaatg(seq id no：9)。

6、优选的，所述的球孢白僵菌(beauveria bassiana)hmbb-1菌落质地为絮状或粉末状，中间稍有凸出，菌丝浓密，初期为乳白色，后逐渐变黄，菌落菌丝层较厚，菌落中央产生较少的白色分生孢子。

7、根据具体实施的需要，所述的球孢白僵菌(beauveria bassiana)hmbb-1还可以经过改造。

8、优选的，所述的改造包括但不限于过表达1-磷酸甘露醇脱氢酶。

9、优选的，所述的1-磷酸甘露醇脱氢酶可以为任何来源。

10、在本发明的一个具体实施方式中，所述的1-磷酸甘露醇脱氢酶来源于白僵菌(beauveria)。

11、本发明的第二方面，提供了一种球孢白僵菌(beauveria bassiana)hmbb-mpd1。

12、优选的，所述的球孢白僵菌(beauveria bassiana)hmbb-mpd1为过表达1-磷酸甘露醇脱氢酶的球孢白僵菌。

13、优选的，所述的1-磷酸甘露醇脱氢酶可以为任何来源。

14、在本发明的一个具体实施方式中，所述的1-磷酸甘露醇脱氢酶来源于白僵菌(beauveria)。

15、优选的，所述的过表达1-磷酸甘露醇脱氢酶的球孢白僵菌可以是任一球孢白僵菌。

16、在本发明的一个具体实施方式中，所述的过表达1-磷酸甘露醇脱氢酶的球孢白僵菌为本技术第一方面所述的球孢白僵菌hmbb-1。

17、优选的，所述的球孢白僵菌hmbb-mpd1菌落质地为絮状或粉末状，中间稍有凸出，菌丝浓密，初期为乳白色，后逐渐变黄。菌丝层较薄，分生孢子呈粉末状，孢子层厚而密，菌株孢子多为球状或椭圆形，颜色无色或者透明。

18、本发明的第三方面，提供了一种构建上述球孢白僵菌(beauveria bassiana)hmbb-mpd1的质粒。

19、所述的质粒包含1-磷酸甘露醇脱氢酶的编码基因。

20、优选的，所述的1-磷酸甘露醇脱氢酶可以为任何来源。

21、在本发明的一个具体实施方式中，所述的1-磷酸甘露醇脱氢酶来源于白僵菌(beauveria)。

22、本发明的第四方面，提供了一种球孢白僵菌(beauveria bassiana)hmbb-mpd1的制备方法。

23、优选的，所述的制备方法包括将1-磷酸甘露醇脱氢酶基因导入球孢白僵菌中。

24、优选的，所述的球孢白僵菌可以是任一球孢白僵菌。

25、在本发明的一个具体实施方式中，所述的球孢白僵菌为本技术第一方面所述的球孢白僵菌hmbb-1。

26、优选的，所述的1-磷酸甘露醇脱氢酶可以为任何来源。

27、在本发明的一个具体实施方式中，所述的1-磷酸甘露醇脱氢酶来源于白僵菌(beauveria)。

28、在本发明的一个具体实施方式中，所述的制备方法包括向球孢白僵菌hmbb-1中导入白僵菌来源的1-磷酸甘露醇脱氢酶的编码基因bbmpd。

29、优选的，所述的制备方法包括构建包含待导入基因的载体(例如质粒)，然后转化进球孢白僵菌中。

30、在本发明的一个具体实施方式中，所述的制备方法包括构建包含bbmpd基因的质粒，转化进球孢白僵菌hmbb-1中。

31、优选的，所述的导入的基因为单拷贝或多拷贝。

32、优选的，导入的1-磷酸甘露醇脱氢酶基因在一个或多个载体上表达或在染色体上表达。

33、在本发明的一个具体实施方式中，所述的制备方法包括：

34、1)设计引物，克隆bbmpd基因；

35、2)转化bbmpd基因。

36、优选的，所述的步骤1)中的克隆bbmpd基因包括pcr扩增及产物检测、阳性克隆筛选、质粒提取、双酶切和连接，获得过表达质粒。

37、优选的，所述的步骤2)中包括原生质体的制备，目的基因转化、转化子继代培养的步骤。

38、本发明的第五方面，提供了一种菌剂。

39、优选的，所述的菌剂中包含上述的球孢白僵菌hmbb-1，和/或，上述的球孢白僵菌hmbb-mpd1，和/或上述的制备方法获得的球孢白僵菌hmbb-mpd1。

40、优选的，所述的菌剂还包含表面活性剂；进一步优选的，所述的表面活性剂包括但不限于吐温-80。

41、优选的，所述的菌剂的类型包括但不限于湿菌体或干粉菌剂。

42、在本发明的一个具体实施方式中，所述的菌剂为培养或发酵上述的球孢白僵菌hmbb-1、上述球孢白僵菌hmbb-mpd1或上述制备方法制备的球孢白僵菌hmbb-mpd1获得的湿菌体。

43、在本发明的一个具体实施方式中，所述的菌剂为将上述湿菌体经干燥后获得的干粉菌剂。

44、本发明的第六方面，提供了一种上述的球孢白僵菌hmbb-1、上述的球孢白僵菌hmbb-mpd1，上述制备方法获得的球孢白僵菌hmbb-mpd1，和/或，上述的菌剂在防治害虫中的应用。

45、优选的，所述的害虫包括但不限于夜蛾科害虫、马尾松毛虫dendrolimuspunctatus、亚洲玉米螟ostriniafurnacalis、二斑叶螨tetranychuscinnabarinus、烟粉虱bemisiatabaci、葱蝇delia antigua、西花蓟马frankliniella occidentalis和马铃薯甲虫leptinotarsa decemlineata。

46、进一步优选的，所述的夜蛾科害虫包括但不限于草地贪夜蛾。

47、优选的，所述的草地贪夜蛾包括草地贪夜蛾的卵、幼虫、蛹和/或成虫；

48、在本发明的一个具体实施方式中，所述的草地贪夜蛾为草地贪夜蛾幼虫。

49、本发明的第七方面，提供了一种防治害虫的方法。

50、优选的，所述的方法包括使用上述的球孢白僵菌hmbb-1、上述的球孢白僵菌hmbb-mpd1，上述制备方法获得的球孢白僵菌hmbb-mpd1，和/或，上述的菌剂；

51、优选的，所述的害虫包括但不限于夜蛾科害虫、马尾松毛虫dendrolimuspunctatus、亚洲玉米螟ostriniafurnacalis、二斑叶螨tetranychuscinnabarinus、烟粉虱bemisiatabaci、葱蝇delia antigua、西花蓟马frankliniella occidentalis和马铃薯甲虫leptinotarsa decemlineata。

52、进一步优选的，所述的夜蛾科害虫包括但不限于草地贪夜蛾。优选的，所述的草地贪夜蛾包括草地贪夜蛾的卵、幼虫、蛹和/或成虫。

53、在本发明的一个具体实施方式中，所述的草地贪夜蛾为草地贪夜蛾幼虫。

54、优选的，所述的球孢白僵菌hmbb-1，或，所述的球孢白僵菌hmbb-mpd1，或，所述的构建方法获得的球孢白僵菌hmbb-mpd1的加入量大于0.02g孢子/m2。

55、优选的，加入量为0.02-0.08g孢子/m2.。

56、优选的，加入量为0.02-0.06g孢子/m2.。

57、优选的，加入量为0.02-0.04g孢子/m2。

58、本发明的第八方面，提供了一种提高球孢白僵菌(beauveria bassiana)抗胁迫能力或提高防治害虫效果的方法。

59、优选的，所述的方法包括向球孢白僵菌中导入1-磷酸甘露醇脱氢酶基因使其过表达。

60、优选的，所述的球孢白僵菌可以是任一球孢白僵菌。

61、在本发明的一个具体实施方式中，所述的球孢白僵菌为本技术第一方面所述的球孢白僵菌hmbb-1。

62、优选的，所述的1-磷酸甘露醇脱氢酶可以为任何来源。

63、在本发明的一个具体实施方式中，所述的1-磷酸甘露醇脱氢酶来源于白僵菌(beauveria)。

64、优选的，所述的胁迫包括但不限于紫外辐射、氧化胁迫、高渗透压胁迫和/或热胁迫等等。

65、优选的，所述的害虫包括但不限于夜蛾科害虫、马尾松毛虫dendrolimuspunctatus、亚洲玉米螟ostriniafurnacalis、二斑叶螨tetranychuscinnabarinus、烟粉虱bemisiatabaci、葱蝇delia antigua、西花蓟马frankliniella occidentalis和马铃薯甲虫leptinotarsa decemlineata。

66、进一步优选的，所述的夜蛾科害虫包括但不限于草地贪夜蛾。

67、优选的，所述的草地贪夜蛾包括草地贪夜蛾的卵、幼虫、蛹和/或成虫。

68、在本发明的一个具体实施方式中，所述的草地贪夜蛾为草地贪夜蛾幼虫。

69、本技术所述的球孢白僵菌与害虫接触后即可开始进行侵染，通过寄生在害虫体内，吸取宿主的养分，抑制宿主昆虫的发育和繁殖，或直接导致其死亡，从而间接减少害虫对植物的损害，其不仅可以用于对马尾松毛虫dendrolimus punctatus、亚洲玉米螟ostriniafurnacalis、二斑叶螨tetranychuscinnabarinus、烟粉虱bemisiatabaci、葱蝇delia antigua、西花蓟马frankliniella occidentalis和马铃薯甲虫leptinotarsadecemlineata等害虫的防治，还可以用于草地贪夜蛾的防治。

70、另外，昆虫病原真菌对环境条件要求比较苛刻，通常它的致病力与其自身的毒力、抗逆性、寄主虫态、生理状况和环境等因素(例如温度、湿度和光照)有关。bbmpd是球孢白僵菌中的1-磷酸甘露醇脱氢酶，负责调控球孢白僵菌在多种胁迫下的耐受性，主要通过调节甘露醇的代谢来促进分生孢子的耐热性、抗紫外能力、抗高渗透压能力、抗氧化能力和毒力。

71、本发明所述的“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。

72、本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“a和/或b”包含了“a”、“a和b”以及“b”。又例如，“a、b和/或c”包含了“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。

73、本发明的优点包括但不限于：

74、1)本发明所述的原始菌株hmbb-1和工程菌株hmbb-mpd1均可用于防治草地贪夜蛾；

75、2)过表达bbmpd基因的工程菌株hmbb-mpd1的抗逆性(例如抗紫外辐照、抗氧化、抗高渗透压、抗热)提高，对草地贪夜蛾(特别是草地贪夜蛾幼虫)的防治效果提高。