一株鳜鱼脑细胞克隆细胞株及其应用的制作方法

本发明属于细胞培养，具体涉及一株鳜鱼脑细胞克隆细胞株及其应用。

背景技术：

1、国际鱼类传代细胞系的鼻祖wolf，国际上第一个鱼类细胞系(魟鳟性腺细胞系rtg，1962)的建立者，公认鱼类细胞培养方法的创建者。自wolf建立世界上第一个鱼类细胞系以来，过去的60多年间，全球范围内的数十种鱼类的数百个细胞系获得成功建系。鱼类细胞的研究远晚于其它动物细胞的研究，但近20年，鱼类细胞的研究得到了非常迅速的发展。

2、细胞系指原代细胞的培养物经过首次传代成功之后而繁殖的细胞群体，也指可长期连续传代的培养细胞。由于没有经过筛选纯化，传代细胞系中细胞种类是不均一的，传代细胞系仅为某类优势群体。细胞株则是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。由于是单个细胞进行分裂增殖而形成具有相同遗传性状的细胞群体。其具有十分相近的形态特征和基本一致的生理、生化特性，在细胞特性、遗传学、功能研究和疫苗制备等方面都有很大的应用。

3、目前常规的单细胞分离技术主要包括有限稀释法、无限稀释法、克隆环法和显微操作法。这四种方法在操作上均有优缺点，但其最终目的均为在一定的培养空间里，放置单个细胞进行培养，其难点在于很多情况下单个细胞生长缓慢甚至不能分裂增殖，或者分裂增殖数天后便开始死亡，导致细胞的克隆形成率很低，无法获得稳定的单细胞克隆株。

4、我国的鱼类细胞单克隆培养研究较少，其缘由于鱼类细胞的研究较其它动物细胞的研究落后。鱼类细胞的研究人员较少，无专研应用于鱼类细胞培养的培养基等原因使得目前鱼类细胞的大多数培养仅限于普通的原代培养和传代培养等，因此迄今为止，我国在鱼类细胞的培养上至今并无报道由单细胞克隆技术获得的单克隆传代细胞株。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一株鳜脑克隆传代细胞株及其应用。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一方面，提供一株鳜脑克隆传代细胞株，于2022年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:62565，分类学名称为鳜脑克隆传代细胞株。

4、本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株在构建细胞库中的应用。

5、本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株在水产动物病毒分离中的应用。

6、在本发明的一些实施方式中，所述水产动物病毒为石斑鱼蛙虹彩病毒、斑石鲷虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒或鲈鱼弹状病毒。

7、本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株在水产动物病毒培养中的应用。

8、在本发明的一些实施方式中，所述水产动物病毒为石斑鱼蛙虹彩病毒、斑石鲷虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒或鲈鱼弹状病毒。

9、本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株在水产动物病毒非诊断目的检测中的应用。

10、在本发明的一些实施方式中，所述水产动物病毒为石斑鱼蛙虹彩病毒、斑石鲷虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒或鲈鱼弹状病毒。

11、本发明的第六方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株在作为研究水产动物病毒的宿主细胞的应用。

12、在本发明的一些实施方式中，所述水产动物病毒为石斑鱼蛙虹彩病毒、斑石鲷虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒或鲈鱼弹状病毒。

13、本发明的第七方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株在筛选和/或制备预防和/或治疗水产动物病毒的药物中的应用。

14、在本发明的一些实施方式中，所述水产动物病毒为石斑鱼蛙虹彩病毒、斑石鲷虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒或鲈鱼弹状病毒。

15、本发明的第八方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株作为药物筛选、药物制备、药物评价、基因筛选和功能分析、病原功能研究、细胞工程育种或免疫相关功能基因研究的生物模型中的应用

16、在本发明的一些实施方式中，所述药物为用于预防和/或治疗水产动物病毒所致的疾病的药物。

17、在本发明的一些实施方式中，所述药物为疫苗。

18、在本发明的一些实施方式中，所述水产动物病毒为石斑鱼蛙虹彩病毒、斑石鲷虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒或鲈鱼弹状病毒。

19、本发明的第九方面，在于提供一种鳜脑克隆传代细胞株的构建方法，包括以下步骤：

20、1)原代培养：取鲜活鳜鱼，取脑组织分散成组织块，使用消化液消化组织块后添加m199营养液进行培养；

21、2)传代培养：待原代细胞长成单层后，加入消化液进行消化，然后加入m199营养液，使细胞分散悬浮，进行传代，继续培养至长成单层；

22、3)单细胞克隆：

23、s1稀释培养：选取刚好长成单层的细胞，加入消化液进行消化，离心弃上清，使用l15克隆营养液重悬后稀释培养；

24、s2细胞传代：细胞长成单层后，加入消化液进行消化，然后加入l15克隆营养液，使细胞分散悬浮，进行传代培养。

25、在本发明的一些实施方式中，在取脑组织之前先将鳜鱼用70～75％酒精浸泡消毒2～3分钟。

26、在本发明的一些实施方式中，取脑组织后用含抗生素的m199培养基洗涤2～4次。

27、在本发明的一些实施方式中，所述脑组织块为0.3～0.5cm3小块脑组织。

28、在本发明的一些实施方式中，原代培养过程中每2～5天更换一次培养液。

29、在本发明的一些实施方式中，所述m199营养液为含有10～20v/v％胎牛血清的m199培养基。

30、在本发明的一些实施方式中，所述m199营养液中还包含200～400iu/ml青霉素和200～400μg/ml链霉素。

31、在本发明的一些实施方式中，所述传代培养中，按1：(2～5)进行传代。

32、在本发明的一些实施方式中，可将步骤s1中的消化后的细胞进行冻存处理。

33、在本发明的一些实施方式中，所述细胞冻存处理中所使用的冻存液为包含35～45v/v％胎牛血清和8～12v/v％二甲基亚砜的m199培养基。

34、在本发明的一些实施方式中，加入细胞冻存液后使细胞分散悬浮，使细胞浓度约(1～3)×106cells/ml。

35、在本发明的一些实施方式中，将冻存后的细胞进行稀释培养时应将细胞后先融化，优选为28～32℃水浴融化。

36、在本发明的一些实施方式中，所述稀释培养具体操作为：将细胞稀释至约200cells/ml，培养20～28小时后补加l15克隆营养液后继续培养；每隔两天更换1/2～1/3l15克隆营养液。

37、在本发明的一些实施方式中，所述l15营养液为包含10～20v/v％胎牛血清的l15培养基。

38、在本发明的一些实施方式中，在细胞传代2～4代次后，可将细胞培养液更换为l15营养液。

39、在本发明的一些实施方式中，所述消化液为0.15～0.35％胰酶消化液。

40、在本发明的一些实施方式中，所述消化的条件为26～30℃8～12min。

41、在本发明的一些实施方式中，所述培养温度为26～30℃。

42、在本发明的一些实施方式中，所述离心的条件为800～1500rpm，2～6min。

43、在本发明的一些实施方式中，当传代培养至显微镜下观察大部分细胞的轮廓清晰时进行单细胞克隆。

44、在本发明的一些实施方式中，所述l15克隆营养液包含：10～30v/v％胎牛血清、10～15v/v％m199细胞生长液、10～15v/v％l15细胞生长液和40～70v/v％l15培养基；l15培养基主要含多种高浓度的氨基酸，以及使用半乳糖作为碳源，其营养较m199更为丰富，适用于快速增殖细胞的培养。m199细胞生长液和l15细胞生长液里面富含原细胞培养过程中产生的多种利于该细胞贴壁和生长的成分，更有利于单个细胞的增殖分裂，以及后期形成单细胞群落。

45、其中所述m199细胞生长液制备方法为：使用m199营养液重悬步骤s1中消化后的细胞，形成70～90％汇合层后收集上清培养液；

46、所述l15细胞生长液制备方法：使用l15营养液重悬步骤s1中消化后的细胞，形成70～90％汇合层后收集上清培养液。

47、在本发明的一些实施方式中，m199细胞生长液和l15细胞生长液需要进一步过滤。

48、在本发明的一些实施方式中，所述过滤为0.1～0.45μm滤膜过滤。

49、本发明的有益效果是：

50、本发明利用普通培养基m199培养基对翘嘴鳜脑组织进行原代培养，若干次传代后成功构建了鳜鱼脑传代细胞系，冻存后使用l15克隆营养液进行复苏稀释培养，稀释培养后各孔单细胞培养成细胞群落后进行传代培养，传代过程均能维持良好的生长状态，细胞形态基本一致。经单细胞克隆后筛选得到的鳜脑克隆传代细胞株可传代50代以上，原始细胞库、基础细胞库和工作细胞库冻存的细胞经复苏均可正常传代，为鱼类细胞单细胞克隆株相关研究奠定基础，并将得到的鳜脑克隆传代细胞株sbcc于2022年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no:62565，分类学名称为鳜脑克隆传代细胞株。

51、而且本发明构建的鳜脑克隆传代细胞株对sgiv、skiv、lmbv、isknv、msrv病毒均十分敏感，当中涵盖了海淡水鱼类病毒，故对海淡水鱼类病毒的分离、鉴定、培养、检测和疫苗研究提供较好的细胞平台。

52、本发明鳜脑克隆传代细胞株的构建方法操作简单，无需任何昂贵仪器和试剂，使用不同代次的传代细胞按本发明技术方案进行单细胞克隆均可制备出多孔单细胞克隆群落，克隆成功率高，重复性极强，使用本技术方案还可应用在构建其它利用m199培养基建立的鱼类传代细胞系的克隆传代细胞株上。