一种三萜二糖苷化合物的制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

阿拉伯吡喃糖苷在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.本发明的齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷经体外药理实验证实，其对人体中枢神经系统肿瘤细胞sf-268、乳腺癌细胞mcf-7、肝癌细胞hepg2以及肺癌细胞a549均具有显著的抑制活性(ic
50
值分别为9.43
±
0.09、11.75
±
0.31、9.38
±
0.47和12.66
±
0.02μm)，而对正常细胞无显著毒副作用。因此具有发展用于制备兼具有效低毒性的抗肿瘤药物的潜质或作为抗肿瘤药物的先导化合物。
9.因此，本发明的化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷能在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.所述的抗肿瘤药物优选为抗神经系统肿瘤、乳腺癌、肝癌或肝癌的药物。
11.本发明的第二个目的是提供一种抗肿瘤药物，其特征在于，含有有效量的齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷作为活性成分和药学上常用辅料或载体。
12.本发明的第三个目的是提供一种齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷的制备方法，其特征在于，化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷是从三叶木通(akebia trifolia(thumb.)koidz)或其变种白木通(akebia trifolia(thumb.)koidz.var.australis(diels)rehd)和长萼三叶木通(akebia trifolia(thumb.)koidz..subsp.longisepala h.n.qin)的茎、叶或果实中制备分离得到的。
13.具体可以是茎叶或果实材料的干品或鲜品，优选果实干品。
14.需要说明的是，果皮和种子为果实的组成部分，因而以果皮和种子为原料制备所述化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷也属于本发明保护范围。
15.具体步骤优选为：
16.a、制备总浸膏：将三叶木通或白木通或长序木通的茎、叶或果实粉碎后用乙醇水溶液浸提，提取液浓缩去除乙醇，得到总浸膏粗提物，将总浸膏粗提物悬浮于水中，先用石油醚萃取后再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物经浓缩后得到乙酸乙酯总浸膏；
17.b、分离纯化：乙酸乙酯总浸膏经正相硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为洗脱剂，依次从体积比8:2，7:3，6:4,0:100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇7:3洗脱下来的馏分，再经反相中压柱层析分离，先用40％的甲醇-水洗脱，然后用55％甲醇-水洗脱并收集此洗脱液部分，然后经sphadex lh-20凝胶柱，以甲醇为洗脱剂，分离纯化得到目标化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷。
18.优选，所述的乙醇水溶液是95％乙醇水溶液。
19.本发明的第四个目的是提供一种三叶木通、白木通和长萼三叶木通的茎、叶或果实在制备齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷中的应用。
20.本发明所述的化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷可以与药学上常用辅料或药物载体结合，制备得到具有齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷抗肿瘤活性的，可用于预防和治疗肿瘤的药物或药物组合物。该药物或药物组合物可以采用可湿性粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸、注射剂、气雾剂等剂型；还可采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。
21.本发明采用我国广泛分布的三叶木通等植物组织中提取分离具显著抗肿瘤活性的齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷，其材料来源丰富，制备过程易于操作，且该单体化合物稳定、易存放，并因为三叶木通等植物为药食植物，所获化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷极可能会是兼具有效性和对人体低毒性的抗肿瘤活性化合物，因而具有较好的应用开发潜质。
附图说明：
22.图1是化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷的1h nmr图谱；
23.图2是化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷的
13
c nmr图谱。
具体实施方式：
24.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
25.实施例1：三叶木通果实中齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷的制备
26.1.1植物来源与鉴定
27.供提取用植物材料三叶木通(akebia trifolia(thumb.)koidz.)的藤茎样品于2020年9月采自湖南省境内，留存样本保存于申请者实验室。
28.1.2提取与分离
29.样品(三叶木通藤茎干品，重2.0公斤)粉碎后用体积分数95％乙醇室温下提取三次，过滤合并滤液减压浓缩除去有机溶剂乙醇，得到总浸膏粗提物。将总浸膏悬浮于500ml水中，用等体积的石油醚提取三次后，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩得到乙酸乙酯总浸膏(27g)。将乙酸乙酯总浸膏用甲醇(250ml)进行溶解，加入正相硅胶(80-100目)以重量比1:1.5拌样挥干，干法装柱(200-300目，550克)干法上样，以氯仿/甲醇为洗脱剂，依次从体积比8:2，7:3，6:4，0:100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇7:3洗脱下来的馏分，再经反相中压柱层析分离，先用40％的甲醇-水洗脱，然后用55％甲醇-水洗脱并收集此洗脱液部分，然后经sephadex lh-20凝胶柱(甲醇)分离纯化得到式(ⅰ)所示的纯化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷(8.2mg)。
30.1.3化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷的结构鉴定
31.所获化合物1为白色粉末状固体，分子式为c
40h64o11
，其1h nmr图谱和
13
c nmr图谱分别如图1和图2所示；esi-ms(+)m/z 743[m+na]
+
；esi-ms(-)m/z 719[m-h]
–
,755[m+cl]-；1h nmr(400mhz,cd3od):δ5.24(1h,br s.,h-12),1.16(3h,s),1.03(3h,s),0.95(3h,s),0.94(3h,s),0.91(3h,s),0.84(3h,s),0.81(3h,s)；
13
c nmr(100mhz,cd3od):δ39.8(ch2,c-1),26.4(ch2,c-2),90.8(ch,c-3),39.8(c,c-4),57.0(ch,c-5),19.3(ch2,c-6),31.7(ch2,c-7),40.3(c,c-8),48.3(ch,c-9),37.9(c,c-10),24.5(ch2,c-11),123.7(ch,c-12),145.2(c,c-13),42.7(c,c-14),28.8(ch2,c-15),24.0(ch2,c-16),47.6(c,c-17),42.8(ch,
c-18),47.2(ch2,c-19),31.6(c,c-20),34.0(ch2,c-21),33.8(ch2,c-22),28.3(ch3,c-23),16.6(ch3,c-24),15.9(ch3,c-25),17.7(ch3,c-26),26.4(ch3,c-27),181.9(c,c-28),23.9(ch3,c-29),21.2(ch3,c-30),105.4(ch,ara-c-1),80.6(ch,ara-c-2),73.6(ch,ara-c-3),68.9(ch,ara-c-4),65.3(ch2,ara-c-5),106.2(ch,xyl-c-1),75.9(ch2,xyl-c-2),77.8(ch,xyl-c-3),71.2(ch,xyl-c-4),67.1(ch2,xyl-c-5)。
[0032]
根据以上质谱和核磁波谱数据的综合分析并与文献对照，可解析推导出该化合物1的化学结构为齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷。
[0033]
实施例2：三叶木通果实中齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷的制备
[0034]
2.1植物来源与鉴定：
[0035]
供提取用植物材料三叶木通(akebia trifolia(thumb.)koidz.)的果实样品于2020年9月采自湖南省境内，留存样本保存于申请者实验室。
[0036]
2.2提取与分离：
[0037]
样品(三叶木通果实干品1.5公斤)粉碎后用体积分数95％乙醇室温下提取三次，过滤合并滤液减压浓缩除去有机溶剂乙醇，得到总浸膏粗提物。将总浸膏悬浮于500ml水中，用等体积的石油醚提取三次后，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩得到乙酸乙酯总浸膏(26.4g)。将乙酸乙酯总浸膏用甲醇(250ml)进行溶解，加入正相硅胶(80-100目)以重量比1:1.5拌样挥干，干法装柱(200-300目，550克)干法上样，以氯仿/甲醇为洗脱剂，依次从体积比8:2，7:3，6:4，0:100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇7:3洗脱下来的馏分，再经反相中压柱层析分离，先用40％的甲醇-水洗脱，然后用55％甲醇-水洗脱并收集此洗脱液部分，然后经sephadex lh-20凝胶柱(甲醇)分离纯化得到式(ⅰ)所示的纯化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷(7.1mg)。
[0038]
实施例3：三叶木通叶中齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷的制备
[0039]
2.3植物来源与鉴定：
[0040]
供提取用植物材料三叶木通(akebia trifolia(thumb.)koidz.)的叶样品于2020年9月采自湖南省境内，留存样本保存于申请者实验室。
[0041]
2.4提取与分离：
[0042]
样品(三叶木通叶干品1.2公斤)粉碎后用体积分数95％乙醇室温下提取三次，过滤合并滤液减压浓缩除去有机溶剂乙醇，得到浓缩的总浸膏粗提物。将总浸膏悬浮于500ml水中，用等体积的石油醚提取三次后，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩得到乙酸乙酯总浸膏(29.4g)。将乙酸乙酯总浸膏用甲醇(250ml)溶解，加入正相硅胶(80-100目)以重量比1:1.5拌样挥干，干法装柱(200-300目，550克)干法上样，以氯仿/甲醇为洗脱剂，依次从体积比8:2，7:3，6:4，0:100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇7:3洗脱下来的馏分，再经反相中压柱层析分离，先用40％的甲醇-水洗脱，然后用55％甲醇-水洗脱并收集此洗脱液部分，然后经sephadex lh-20凝胶柱(甲醇)分离纯化得到式(ⅰ)所示的纯化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷(3.8mg)。
[0043]
实施例4：
[0044]
以白木通和长萼三叶木通的茎叶干品为材料，按照实施例1的提取和分离方法能
分离得到齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷。
[0045]
实施例5：
[0046]
以白木通和长萼三叶木通的果实干品为材料，按照实施例2的提取和分离方法能分离得到齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷。
[0047]
实施例6：齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷的抗肿瘤活性检测6.1仪器与材料
[0048]
细胞株与细胞培养液：四种人源肿瘤细胞株即中枢神经系统肿瘤细胞(sf-268)、乳腺癌细胞(mcf-7)、肝癌细胞(hepg2)、肺癌细胞(nci-h460)来源于广东省微生物所；rpmi1640培养基(gibaco)，胎牛血清(fbs，gibaco)，胰蛋白酶(trypsin 1:250，amersco)，pbs(实验室配制)。
[0049]
实验仪器：酶标仪genois microplate reader(tecan genios,swizerland)。
[0050]
试剂与样品：二甲基亚砜(dmso,分析纯)，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(mtt,sigma)，阿霉素(pfizer italia srl)；齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷由以上实验例中制备。
[0051]
6.2测试方法：
[0052]
a)肿瘤细胞培养：4株人源肿瘤细胞株均为贴壁细胞，培养用液为rpmi164培养基加10％的fbs和1％双抗，均培养于37℃、5％co2饱和湿度co2培养箱中。当细胞铺满培养皿底部90％时即可传代。取对数生长期的细胞进行实验。
[0053]
b)受试样品的配制：将化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷、阿霉素、分别由二甲基亚砜(dmso)配制成10mg/ml的溶液，然后用培养基稀释至最终处理浓度。
[0054]
c)采用mtt法，通过采用96孔板完成化合物齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷对肿瘤细胞的半数抑制浓度测定。
[0055]
首先消化收集对数生长期的细胞，调整细胞悬液浓度使细胞浓度达到5
×
104细胞/ml接种到96孔板，每孔加入100μl。将96孔板，37℃、5％co2培养箱孵育24h。吸去上清液，然后每孔中加入100μl的新鲜培养基和含实验所需浓度样品液的培养基100μl，完全混匀，使每孔最终浓度为200μl。实验分设不同浓度受试样品组、空白对照组(不加入样品)、阳性对照组(阿霉素)。受试样品组每个样品设6个浓度梯度，每个浓度设4个复孔。在37℃、5％co2培养箱中培养72h，每孔加入mtt 20μl(5mg/ml),继续孵育4h,然后离心去掉上层培养液，每孔加入150μl的dmso,在振荡器上充分振荡溶解生成的结晶，15min后,放入酶标仪在570nm波长测定吸光值(od)。化合物抑制率计算公式如下：抑制率(％)＝(od
control
–
od
treated
)/od
control
×
100％。其中，测试化合物对肿瘤细胞的半数抑制浓度(ic
50
)采用ic
50
计算软件(logit法)计算(xu,x.y.；xie,h.h.；hao,j.；jiang,y.m.；wei,x.y.eudesmane sesquiterpene glucosides from lychee seed and their cytotoxic activity.food chem.,2010,123:1123
–
1126)。
[0056]
6.3实验数据参见表1：
[0057]
表1.齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷的体外抗肿瘤细胞活性ic
50
(μm)
[0058][0059][0060]
6.4实验结论：
[0061]
本发明提供的齐墩果酸-3-o-β-d-木糖吡喃基-(1
→
2)-α-l-阿拉伯吡喃糖苷，经体外药理实验证实，其对人体中枢神经系统肿瘤细胞sf-268、乳腺癌细胞mcf-7、肝癌细胞hepg2、以及肺癌细胞nci-h460均具较显著的抑制活性(ic
50
值分别为9.43
±
0.09、11.75
±
0.31、9.38
±
0.47和12.66
±
0.02μm，并且作为自三叶木通等可食性植物资源分离的糖苷类成分，其会兼具有低的毒性和好的水溶性等多重优特点，因而具有发展用于制备相关抗肿瘤药物的潜力，亦或是可作为相关抗肿瘤药物开发的先导化合物。