双特异性抗体修饰囊泡、双特异性抗体、核酸、重组载体、基因工程细胞、方法和应用

本发明涉及生物医药，进一步涉及抗体，特别涉及一种双特异性抗体修饰囊泡、双特异性抗体、核酸、重组载体、基因工程细胞、基因工程细胞的制备方法、双特异性抗体修饰囊泡的制备方法、应用、药物组合物以及双特异性抗体修饰囊泡中双特异性抗体的结合密度的测试方法。

背景技术：

1、双特异性抗体(bsab)是一类在治疗癌症方面有着巨大前景的生物制剂，bsab由肽链连接两个抗体单链可变片段组成，分别可识别靶细胞和效应细胞，能在两者间起到桥梁连接作用。例如，bispecific t cell engager(bite，双特异性t细胞结合器)是双特异性抗体的一种，其效应细胞识别端通过结合t细胞表面的cd3e可有效激活t细胞，并介导t细胞对肿瘤细胞的不依赖mhc复合物的杀伤效应。又如，(blinatumomab)是一种结合t细胞上的cd3和靶细胞上的cd19的bite，是fda批准的第一个双特异性免疫治疗药物，已被证明对cd19+b细胞前体all(急性淋巴细胞白血病)有效，目前用于费城染色体阴性复发或难治性all患者的二线治疗。相比于嵌合抗原受体t细胞(car-t)疗法，前述的bsab免疫疗法可以引导t细胞向肿瘤细胞趋向，而且双特异性免疫治疗药可以生产为成品药物，易于控制剂量，并且降低了患者个人的用药成本。然而，bites和其他基于双特异性抗体的生物制剂均属于蛋白制剂，半衰期短，使用时不可避免的会有损耗，在临床上需要注射泵连续给药，便捷性差，患者用药过程长，依从性差。基于此，目前亟待开发新的双特异性抗体药物。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的包括提供一种双特异性抗体修饰囊泡，可以显著延长双特异性抗体药物的半衰期，降低临床上需要注射泵连续给药的压力，可增加患者依从性。本发明还提供双特异性抗体、核酸、重组载体、基因工程细胞、基因工程细胞的制备方法、双特异性抗体修饰囊泡的制备方法、应用(如在制备药物中的应用)、药物组合物和双特异性抗体修饰囊泡中双特异性抗体的结合密度的测试方法。

2、在本发明的第一方面，提供一种双特异性抗体(bsab)修饰囊泡，其包括囊泡和结合于所述囊泡表面的双特异性抗体(bsab)；

3、其中，所述双特异性抗体与所述囊泡表面的膜结构相结合；所述双特异性抗体包括第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域；所述第一抗原结合结构域为cd19抗原结合结构域或her2抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域为cd3抗原结合结构域。

4、在一些实施方式中，所述双特异性抗体在所述囊泡表面的结合密度为每平方微米囊泡表面结合的asab的平均数量大于100个；和/或，所述双特异性抗体修饰囊泡的直径为80～1000nm，优选平均直径为100～200nm。

5、在一些实施方式中，任一种所述双特异性抗体独立地为bite抗体。

6、在一些实施方式中，任一种所述双特异性抗体独立地包括依次串联的所述第一抗原结合结构域、连接肽、所述第二抗原结合结构域、铰链区和跨膜结构域；其中，所述跨膜结构域嵌入到所述囊泡表面的磷脂双分子层中而结合。

7、在一些实施方式中，所述双特异性抗体修饰囊泡满足如下的任意一个特征、任意多个部分特征或全部特征：

8、(a1)所述第一抗原结合结构域包含氨基酸序列如seq id no.:1所示的抗cd19单链抗体可变区，或者，包含氨基酸序列如seq id no.:2所示的抗her2单链抗体可变区；

9、(a2)所述所第二抗原结合结构域包含氨基酸序列如seq id no.:3所示的抗cd3单链抗体可变区；

10、(a3)所述连接肽的氨基酸序列如seq id no.:4所示；

11、(a4)所述铰链区的氨基酸序列如seq id no.:5所示；和

12、(a5)所述跨膜结构域的氨基酸序列如seq id no.:6所示。

13、在一些实施方式中，所述囊泡来源于哺乳动物细胞和昆虫细胞中的一种或多种。

14、在一些实施方式中，所述囊泡来源于hek-293t细胞、nalm6细胞和raw264.7细胞中的一种或多种。

15、在本发明的第二方面，提供一种双特异性抗体，其如本发明的第一方面中所定义。

16、在本发明的第三方面，提供一种核酸，所述核酸的核苷酸序列包括以下至少一组中的核苷酸序列：

17、(i)编码本发明的第二方面所述双特异性抗体的核苷酸序列；和

18、(ii)与(i)中所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

19、优选地，所述核酸为dna、mrna或者其组合。

20、在一些实施方式中，在所述双特异性抗体的编码序列上游还包括编码信号肽的核苷酸序列，优选地，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.:7所示。

21、在本发明的第四方面，提供一种重组载体，所述重组载体含有本发明的第二方面所述双特异性抗体的编码序列和本发明的第三方面所述核酸的核苷酸序列中的一种或多种。

22、在一些实施方式中，所述重组载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、瞬时转染载体和腺载体中的一种或多种。

23、在本发明的第五方面，提供一种基因工程细胞，所述基因工程细胞能够内源性分泌囊泡，且所述基因工程细胞的基因组整合有本发明的第二方面所述双特异性抗体的编码序列和本发明的第三方面所述核酸的核苷酸序列中的一种或多种，或者所述基因工程细胞的细胞内含有重组载体，所述重组载体含有本发明的第二方面所述双特异性抗体的编码序列和本发明的第三方面所述核酸的核苷酸序列中的一种或多种；

24、其中，所述囊泡的表面具有磷脂双分子层。

25、在本发明的第六方面，提供一种基因工程细胞的制备方法，其包括如下步骤：

26、提供能够内源性分泌囊泡的母细胞并提供重组载体；其中，所述囊泡的表面具有磷脂双分子层；所述重组载体含有本发明的第二方面所述双特异性抗体的编码序列和本发明第三方面所述核酸的核苷酸序列中的一种或多种；

27、将所述的重组载体转化或转染到所述的母细胞中。

28、在一些实施方式中，所述的母细胞的浓度为1×105个/ml～1×106个/ml，感染指数moi为1～10。

29、在一些实施方式中，所述母细胞选自哺乳动物细胞和昆虫细胞中的一种或多种；

30、其中，所述哺乳动物细胞包括hek-293t细胞、nalm6细胞和raw264.7细胞中的一种或多种。

31、在本发明的第七方面，提供一种双特异性抗体修饰囊泡的制备方法，其包括如下步骤：

32、提供本发明的第五方面所述基因工程细胞或者本发明的第六方面所述的制备方法制备得到的基因工程细胞；其中，所述基因工程细胞包含本发明的第一方面中所定义的双特异性抗体的第一编码序列，还包括位于所述第一编码序列上游的第二编码序列，所述第二编码序列编码信号肽；

33、培养所述基因工程细胞，制得所述双特异性抗体修饰囊泡。

34、在一些实施方式中，所述的制备方法具备如下的一个或多个特征：

35、(t1)所述培养所述基因工程细胞的步骤包括如下过程：所述基因工程细胞在所述外源刺激条件下分泌囊泡，合成c端带有信号肽的双特异性抗体，所述双特异性抗体的c端在所述信号肽介导下嵌入到所述基因工程细胞表面的磷脂双分子层，所述基因工程细胞以出芽的方式分泌囊泡，位于所述双特异性抗体的c端的所述信号肽被切除；

36、(t2)所述培养所述基因工程细胞在紫外光照下进行，紫外光波长为280～315nm，照射强度为300～400j/m2；和，

37、(t3)所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.:7所示。

38、在本发明的第八方面，提供本发明的第一方面所述双特异性抗体修饰囊泡，本发明的第二方面所述双特异性抗体，本发明的第三方面所述核酸，本发明的第四方面所述重组载体，本发明的第五方面所述基因工程细胞，本发明的第六方面所述的制备方法制备得到的基因工程细胞，或本发明的第七方面所述的制备方法制备得到的双特异性抗体修饰囊泡在制备预防和/或治疗肿瘤或癌症的药物中的应用。

39、在本发明的第九方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明的第一方面所述双特异性抗体修饰囊泡以及本发明的第七方面所述的制备方法制备得到的双特异性抗体修饰囊泡中的至少一种；所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

40、在本发明的第十方面，提供本发明的第一方面所述双特异性抗体修饰囊泡中双特异性抗体的结合密度的测试方法，其特征在于，包括如下步骤：

41、获取荧光标记物的荧光值-浓度的标准曲线；

42、配制包含所述双特异性抗体修饰囊泡的混合液a，其中，每个双特异性抗体单元均携带一个所述荧光标记物；

43、利用所述荧光标记物的荧光值-浓度的标准曲线计算出所述双特异性抗体单元在所述混合液a中的浓度cbsab；并采用纳米颗粒跟踪分析方法测定所述双特异性抗体修饰囊泡在所述混合液a中的浓度cbsab-ev；

44、根据所述cbsab和所述cbsab-ev计算得出平均一个所述双特异性抗体修饰囊泡结合的双特异性抗体单元数量nbsab@ev。

45、在一些实施方式中，所述双特异性抗体修饰囊泡中双特异性抗体的结合密度的测试方法还包括如下步骤：采用纳米颗粒跟踪分析方法测定所述双特异性抗体修饰囊泡的平均粒径dbsab-ev，再结合所述nbsab@ev计算得出所述双特异性抗体修饰囊泡每单位表面积结合的双特异性抗体单元数量ρbsab@ev。

46、本发明的第一方面提供的双特异性抗体修饰囊泡以及本发明的第七方面制备的双特异性抗体修饰囊泡，可以显著延长双特异性抗体药物的半衰期，降低临床上需要注射泵连续给药的压力，可增加患者依从性，进一步地，还可降低患者经济负担。

47、本发明的第一方面提供的双特异性抗体修饰囊泡以及本发明的第七方面制备的双特异性抗体修饰囊泡还可以包载其他药物成分，进而有效克服bites和其他基于双特异性抗体的生物制剂仅仅调动一类免疫细胞的瓶颈，可以为目前单一疗法很难彻底治疗的肿瘤，尤其是实体瘤治疗提供有效的药物制剂(药物组合物)或药品。