CLDN18.2抗体及其用途的制作方法

本公开涉及免疫治疗领域。具体而言，本公开涉及结合cldn18.2的抗体及其去岩藻糖化的形式，及其在治疗疾病特别是癌症中的应用。

背景技术：

0、技术背景

1、包括胃癌及食道癌在内的上消化道肿瘤是一种全球常见，预后较差的恶性肿瘤。胃癌在中国尤其高发，全球有近42％的胃癌新发病例集中在中国。由于缺乏早期诊断，约80％胃癌患者发现时已是晚期。由于胃癌对常规化疗药物不够敏感，晚期胃癌的五年生存率极低，并已成为中国第三大致死的恶性肿瘤。因此，近年的研究致力于寻找胃癌特异性的靶向治疗。

2、封闭蛋白(claudin)家族蛋白是广泛分布于上皮细胞中的紧密连接结构的主要组成部分。和其它封闭蛋白家族蛋白的结构类似，cldn18.2是分子量约27.8kd，具有四个跨膜区的膜蛋白，且具有两个较短的胞外区ec1和ec2。与其它封闭蛋白家族蛋白不同的是，在正常组织中cldn18.2非常特异地仅表达于胃部高度分化的上皮细胞中(tureci o et al.,gene,2011)。在来源于胃上皮细胞的肿瘤中，有很高比例的肿瘤细胞表面表达cldn18.2。在胃癌细胞的淋巴结和其它组织转移肿瘤中，也可以检测到高水平的cldn18.2表达(wolls.et al.,int.j.cancer,2013)。除胃癌外，也有很高比例的胆管癌、食道癌和胰腺癌等肿瘤细胞中表达cldn18.2。作为特异性表面标志物，cldn18.2成为癌症治疗的潜在靶点。研发针对cldn18.2的高效抗体药物将为多种癌症的治疗提供可能，具有巨大的应用潜力和市场价值。

3、治疗性单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的主要作用机制之一是adcc效应(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，antibody dependent cell mediated cytotoxicity)。通过治疗性抗体的抗原识别段(fab)与肿瘤细胞表面的特异性抗原结合后，利用抗体恒定区(fc)与表达fc受体(fcγr)的效应细胞结合来激活效应细胞的细胞杀伤活性，从而分泌细胞毒性介质包括颗粒酶和穿孔素等，最终导致靶细胞(肿瘤细胞)的溶解破坏。抗体对抗原的结合力强弱，抗原表达丰度以及抗体fc区和效应细胞表面的fc受体的结合力强弱均可影响adcc效应的强度，进而影响癌症的治疗效果(jefferis and lund,2002)。

技术实现思路

0、发明概述

1、本公开提供了新的抗cldn18.2的抗体。上述抗体能够以高亲和力和特异性结合cldn18.2，并介导效应细胞对表达cldn18.2的靶细胞(例如肿瘤细胞)的杀伤。此外，还生成了上述抗体的去岩藻糖化形式，其能够比普通抗体更好地结合fcγriia并诱导adcc效应。

2、相应地，在一方面，本公开涉及一种结合cldn18.2的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有以下重链cdr(cdrh)和轻链cdr(cdrl)：

3、a.如seq id no:1中所示的重链可变区(vh)中的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seqid no:6中所示的轻链可变区(vl)中的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

4、b.如seq id no:11中所示的vh中的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:16中所示的vl中的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

5、c.如seq id no:21中所示的vh中的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:26中所示的vl中的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

6、d.如seq id no:31中所示的vh中的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:36中所示的vl中的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

7、e.如seq id no:41中所示的vh中的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:46中所示的vl中的cdrl1、cdrl2和cdrl3；或

8、f.如seq id no:55中所示的vh中的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:60中所示的vl中的cdrl1、cdrl2和cdrl3。

9、在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体具有以下cdrh和cdrl：

10、a.如seq id no:3-5中所示的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:8-10中所示的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

11、b.如seq id no:13-15中所示的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:18-20中所示的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

12、c.如seq id no:23-25中所示的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:28-30中所示的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

13、d.如seq id no:33-35中所示的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:38-40中所示的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

14、e.如seq id no:43-45中所示的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:48-50中所示的cdrl1、cdrl2和cdrl3；或

15、f.如seq id no:57-59中所示的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:62-64中所示的cdrl1、cdrl2和cdrl3。

16、在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体具有以下vh和vl：

17、a.包含seq id no:1的氨基酸序列的vh，和包含seq id no:6的氨基酸序列的vl；

18、b.包含seq id no:11的氨基酸序列的vh，和包含seq id no:16的氨基酸序列的vl；

19、c.包含seq id no:21的氨基酸序列的vh，和包含seq id no:26的氨基酸序列的vl；

20、d.包含seq id no:31的氨基酸序列的vh，和包含seq id no:36的氨基酸序列的vl；

21、e.包含seq id no:41的氨基酸序列的vh，和包含seq id no:46的氨基酸序列的vl；

22、f.包含seq id no:55的氨基酸序列的vh，和包含seq id no:60的氨基酸序列的vl。

23、在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体可以具有如seqid no:51所示的重链恒定区序列和/或如seq id no:53所示的轻链恒定区序列。

24、在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体具有fc区。在一些实施方案中，所述抗体可以在asn297处具有糖基结构修饰，其中根据eu编号系统编号。在一些实施方案中，所述糖基结构中具有岩藻糖的糖基结构的比例为50％或更少。在一些实施方案中，所述糖基结构中具有岩藻糖的糖基结构的比例为不高于30％，例如不高于20％，不高于10％，不高于5％，不高于2％或不高于1％。

25、在优选的实施方案中，所述抗体中具有岩藻糖的糖基结构的比例为0％-1％。

26、在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体由fut8基因敲除的细胞产生。在一些实施方案中，所述细胞可以选自cho细胞和hek293细胞。

27、在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，相比于在不具有fut8基因敲除的细胞中产生的抗体，所述抗体具有增加的fcγriiia结合活性。在一些实施方案中，相比于在不具有fut8基因敲除的细胞中产生的抗体，所述抗体具有增加的adcc活性。

28、在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体可以是单克隆抗体。在另一些实施方案中，所述抗体可以是双特异性抗体或多特异性抗体。

29、在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体可以选自igg、iga、igm、ige和igd同种型。在一些实施方案中，所述抗体可以选自igg1、igg2、igg3和igg4亚型。

30、在本公开的抗体或其抗原结合片段的任何实施方案中，所述抗原结合片段可以选自fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、fd片段、fd’片段、fv片段、scfv片段、ds-scfv片段、dab片段、单链片段、二价抗体和线性抗体。

31、在一个方面，本公开涉及一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本公开的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

32、在另一个方面，本公开涉及一种载体，所述载体包含本公开的核酸分子。

33、在再一个方面，本公开涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本公开的核酸分子或载体。

34、在一个方面，本公开涉及一种缀合物，所述缀合物包含与治疗剂、诊断剂或显像剂缀合的本公开的任何抗体或其抗原结合片段。

35、在另一个方面，本公开涉及一种组合物，所述组合物包含本公开的抗体或其抗原结合片段或缀合物，以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。

36、在一些实施方案中，所述治疗剂可以选自抗体、化疗药物和小分子药物。在一些实施方案中，所述化疗药物可以选自表柔比星(epirubicin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和5-氟尿嘧啶(5-fu)的一种或多种。

37、在一个方面，本公开涉及一种治疗受试者中与cldn18.2的表达相关的疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用本公开的抗体或其抗原结合片段、缀合物或组合物的步骤。

38、在一些实施方案中，所述疾病是癌症。例如，所述癌症可以选自胃癌、胆管癌、食道癌和胰腺癌。

39、在一些实施方案中，所述方法还包括对所述受试者施用一种或多种另外的疗法例如癌症疗法的步骤。在一些实施方案中，所述另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法和手术治疗。

40、在一些实施方案中，所述免疫疗法选自针对免疫检查点分子的疗法、car-t细胞治疗和car-nk细胞治疗。

41、在一些实施方案中，所述化学疗法选自包括表柔比星、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的联合化疗方案。

42、在一个方面，本公开涉及本公开的抗体或其抗原结合片段、缀合物或组合物在治疗受试者中与cldn18.2的表达相关的疾病中的用途。

43、在另一个方面，本公开涉及本公开的抗体或其抗原结合片段、缀合物或组合物在制备用于治疗受试者中与cldn18.2的表达相关的疾病的药物中的用途。

44、在本公开的用途的一些实施方案中，所述疾病是癌症。例如，所述癌症可以选自胃癌、胆管癌、食道癌和胰腺癌。

45、在一个方面，本公开涉及一种多肽，所述多肽具有选自seq id no:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、55和60的氨基酸序列。

46、在另一个方面，本公开涉及一种核酸分子，所述核酸分子具有选自seq id no:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、56和61的核苷酸序列。本公开还涉及包含上述核酸分子的载体。

47、本发明涉及以下各项：

48、1.一种结合cldn18.2的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有以下重链cdr(cdrh)和轻链cdr(cdrl)：

49、a.如seq id no:1中所示的重链可变区(vh)中的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seqid no:6中所示的轻链可变区(vl)中的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

50、b.如seq id no:11中所示的vh中的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:16中所示的vl中的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

51、c.如seq id no:21中所示的vh中的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:26中所示的vl中的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

52、d.如seq id no:31中所示的vh中的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:36中所示的vl中的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

53、e.如seq id no:41中所示的vh中的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:46中所示的vl中的cdrl1、cdrl2和cdrl3；或

54、f.如seq id no:55中所示的vh中的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:60中所示的vl中的cdrl1、cdrl2和cdrl3。

55、2.如项1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有以下cdrh和cdrl：

56、a.如seq id no:3-5中所示的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:8-10中所示的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

57、b.如seq id no:13-15中所示的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:18-20中所示的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

58、c.如seq id no:23-25中所示的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:28-30中所示的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

59、d.如seq id no:33-35中所示的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:38-40中所示的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

60、e.如seq id no:43-45中所示的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:48-50中所示的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

61、f.如seq id no:57-59中所示的cdrh1、cdrh2和cdrh3；和如seq id no:62-64中所示的cdrl1、cdrl2和cdrl3。

62、3.如项1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有以下vh和vl：

63、a.包含seq id no:1的氨基酸序列的vh，和包含seq id no:6的氨基酸序列的vl；

64、b.包含seq id no:11的氨基酸序列的vh，和包含seq id no:16的氨基酸序列的vl；

65、c.包含seq id no:21的氨基酸序列的vh，和包含seq id no:26的氨基酸序列的vl；

66、d.包含seq id no:31的氨基酸序列的vh，和包含seq id no:36的氨基酸序列的vl；

67、e.包含seq id no:41的氨基酸序列的vh，和包含seq id no:46的氨基酸序列的vl；

68、f.包含seq id no:55的氨基酸序列的vh，和包含seq id no:60的氨基酸序列的vl。

69、4.如项1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有fc区。

70、5.如项4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体在asn297处具有糖基结构修饰，其中根据eu编号系统编号。

71、6.如项5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述糖基结构中具有岩藻糖的糖基结构的比例为50％或更少。

72、7.如项6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述糖基结构中具有岩藻糖的糖基结构的比例为30％或更少，例如20％或更少，10％或更少，5％或更少，2％或更少或1％或更少。

73、8.如项6所述的抗体或其抗原能结合片段，其中所述抗体中具有岩藻糖的糖基结构的比例为0％-1％。

74、9.如项6-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体由fut8基因敲除的细胞产生。

75、10.如项9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞选自cho细胞和hek293细胞。

76、11.如项9或10所述的抗体或其抗原结合片段，其中相比于在不具有fut8基因敲除的细胞中产生的抗体，所述抗体具有增加的fcγriiia结合活性。

77、12.如项9-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中相比于在不具有fut8基因敲除的细胞中产生的抗体，所述抗体具有增加的adcc活性。

78、13.如项1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。

79、14.如项1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。

80、15.如项1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自igg、iga、igm、ige和igd同种型。

81、16.如项1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自igg1、igg2、igg3和igg4亚型。

82、17.如项1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、fd片段、fd’片段、fv片段、scfv片段、ds-scfv片段、dab片段、单链片段、二价抗体和线性抗体。

83、18.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码如项1-17中任一项的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

84、19.一种载体，所述载体包含如项18所述的核酸分子。

85、20.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如项18所述的核酸分子或如项19所述的载体。

86、21.一种缀合物，所述缀合物包含与治疗剂、诊断剂或显像剂缀合的如项1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

87、22.一种组合物，所述组合物包含如项1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或如项21所述的缀合物，和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

88、23.如项22所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。

89、24.项23所述的组合物，其中所述治疗剂选自抗体、化疗药物和小分子药物。

90、25.项24所述的组合物，其中所述化疗药物选自表柔比星(epirubicin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和5-氟尿嘧啶(5-fu)的一种或多种。

91、26.一种治疗受试者中与cldn18.2的表达相关的疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用如项1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，如项21所述的缀合物，或如项22-25中任一项所述的组合物的步骤。

92、27.如项26所述的方法，其中所述疾病是癌症。

93、28.如项27所述的方法，其中所述癌症选自胃癌、胆管癌、食道癌和胰腺癌。

94、29.如项26-28中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对所述受试者施用一种或多种另外的疗法的步骤。

95、30.如项29所述的方法，其中所述另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法和手术治疗。

96、31.如项30所述的方法，其中所述免疫疗法选自针对免疫检查点分子的疗法、car-t细胞治疗和car-nk细胞治疗。

97、32.如项30所述的方法，其中所述化学疗法选自包括表柔比星、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的联合化疗方案。

98、33.如项1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，如项21所述的缀合物，或如项22-25中任一项所述的组合物在治疗受试者中与cldn18.2的表达相关的疾病中的用途。

99、34.如项1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，如项21所述的缀合物，或如项22-25中任一项所述的组合物在制备用于治疗受试者中与cldn18.2的表达相关的疾病的药物中的用途。

100、35.如项33或34所述的用途，其中所述疾病是癌症。

101、36.如项35所述的用途，其中所述癌症选自胃癌、胆管癌、食道癌和胰腺癌。

102、37.一种多肽，所述多肽具有选自seq id no:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、55和60的氨基酸序列。

103、38.一种核酸分子，所述核酸分子具有选自seq id no:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、56和61的核苷酸序列。

104、39.一种载体，所述载体包含如项38所述的核酸分子。