一种基于SNP分子标记鉴定洋葱雄性不育三系配套杂交种纯度的方法

一种基于snp分子标记鉴定洋葱雄性不育三系配套杂交种纯度的方法
技术领域
1.本发明属于洋葱育种技术领域，具体涉及一种基于snp的kasp分子标记鉴定洋葱雄性不育三系配套杂交种纯度的方法。


背景技术：

2.洋葱(allium cepa l.)石蒜科(amaryllidaceae)葱属(allium)二年生草本植物，起源于中亚。我国是洋葱生产和出口大国。目前，洋葱大部分商品种子使用的是杂交种。杂交种的遗传真实性是种子质量的重要标志之一，它直接影响洋葱生产的产量、商品性和品质。随着洋葱杂交种的广泛应用和种业市场的日趋成熟，洋葱杂交种纯度快速检验的重要性越来越突出。
3.洋葱杂交种生产主要是利用细胞质雄性不育的三系法，需要同时具有不育系、保持系和父本系。不育系基因型为s(msms)，不能产生有活力的花粉，不能自交结实。保持系基因型为n(msms)，花粉是可育的，通过与不育系杂交，不育系得以繁殖并保持不育性状。父本系基因型为n/s(msms)，通过不育系(母本)与父本自交系杂交生产杂交种子，杂交种的基因型为s(msms)。一般情况下，亲本纯合性越高，杂交种的优势越强。
4.目前，洋葱杂交种已经广泛应用于生产，但在杂交种子生产过程中，由于父本拔除不彻底，隔离措施不当或者机械混杂，均有可能导致杂交种子不纯。因此，杂交种在包装销售前，必须通过种子纯度鉴定。传统的杂交种纯度鉴定主要通过田间形态学观察鉴定，需要观察发育阶段品种的特征特异，存在周期长、工作量大、成本高、易受环境影响等缺陷，不利于种子的及时销售，难以满足市场的鉴别需求。因此，开发准确而高效的杂交种子纯度鉴定方法是迫切需要解决的关键问题。
5.随着分子生物学技术的发展，基于dna多态性的分子标记正逐渐成为农作物种子鉴定的有力工具。洋葱dna的有效提取是分子标记鉴定杂交种纯度的前提和基础，也是较为关键的步骤。传统方法是以叶片作为dna的提取材料，需要在播种后15-20天的苗期才能进行dna提取操作，所需周期较长。现有技术中，尚未见有利用洋葱种子提取dna进行分子标记杂交种纯度鉴定的相关报道。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于snp分子标记鉴定洋葱雄性不育三系配套杂交种纯度的方法。本发明采用洋葱种子提取基因组dna用于杂交种的纯度检测，代替传统杂交种的纯度鉴定方法，有效的将杂交种与父本和母本区分开来，快速、准确地检测出洋葱杂交种的纯度。
7.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
8.一方面，一种基于snp分子标记鉴定洋葱雄性不育三系配套杂交种纯度的方法，所述方法包括以下步骤：
ms和1条下游引物hi-c，两条上游引物5'端连接有荧光标签序列，3'末端包含等位变异碱基c/g；
26.所述特异性引物核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3所示。
27.seq id no.1(hi-ms)：下划线部分为fam荧光标签序列
28.gaaggtgaccaagttcatgc gaagaggttcgagaaatatttcatttac
29.seq id no.2(hi-ms)：下划线部分为hex荧光标签序列
30.gaaggtcggagtcaacgga gaagaggttcgagaaatatttcatttag
31.seq id no.3(hi-c)：
32.ctagaagctgtgtattgcatgaatgakata
33.所述荧光标签序列还可以采用其他本领域通用的荧光标签序列。
34.该实施方式的一些实施例中，引物hi-ms和hi-c扩增读出父本自交系种子(细胞核基因型为msms)，扩增产物的荧光信号呈黄色圆点标记；hi-ms和hi-c扩增读出母本不育系的种子(细胞核基因型为msms)，扩增产物的荧光信号呈红色圆点标记；真实的洋葱杂交种，hi-ms，hi-ms都有可以与hi-c扩增，扩增产物的荧光信号呈绿色圆点标记。
35.该实施方式的一些实施例中，(3)中，pcr反应结束后，酶标仪pherastar上进行读板，采用snpviewer2软件对扫描数据进行分析，采用snpviewer2软件对扫描数据进行分析具体为：若待测dna扩增产物的荧光信号数据经snpviewer2分析后呈红色圆点标记，则该洋葱种子的细胞核基因型为隐形纯合的msms，为母本不育系的种子；若待测dna扩增产物的荧光信号呈黄色圆点标记，则该洋葱种子的细胞核基因型为显性纯合的msms，为父本自交系种子；若待测dna扩增产物的荧光信号呈绿色圆点标记，则该洋葱种子的基因型为杂合的msms，为真实的洋葱杂交种。若待测dna扩增产物的荧光信号数据经snpviewer2分析后呈粉色，则为无效结果。
36.该实施方式的一些实施例中，所述方法还包括纯度计算步骤，计算杂交种子粒数占检测种子总粒数的百分比。
37.纯度计算：具有绿色圆点标记的杂交种子粒数占检测种子总粒数的百分比，计算公式如下：
38.种子纯度＝杂交种子数量/检测种子总数量
×
100％。
39.该实施方式的一些实施例中，(1)中，dna的提取方法为：取洋葱种子于离心管中，加入tps缓冲液和rnase，种子破碎后水浴加热30分钟，离心；取上清液至离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后离心，弃上清；加入乙醇，涡旋振荡后离心，弃上清；彻底晾干残余的乙醇后加入无菌ddh2o，溶解dna沉淀，冻存备用。
40.优选的，水浴加热过程中颠倒混匀2-3次。
41.优选的，70-90℃水浴加热30分钟，进一步优选为80℃。
42.优选的，所述乙醇为60-90％乙醇，优选为70％乙醇。
43.该实施方式的一些实施例中，(2)中，pcr扩增的反应程序包括：90-95℃预变性15min；90-95℃变性20s，61-55℃退火1min，每一个循环降低0.6℃，10个循环；90-95℃变性20s，61-55℃退火1min，26-29个循环。
44.优选的，(2)中，pcr扩增的反应程序包括：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃退火1min，每一个循环降低0.6℃，10个循环；94℃变性20s，55℃退火1min，26-29个循环。
45.该实施方式的一些实施例中，所述对提取的dna进行kasp-pcr扩增方法包括：
46.a)将样本从96孔板中转移至384孔板中，再最终转移至1536孔板中，确保样本dna终浓度约为10ng/μl；
47.b)将装有dna样本的1536孔板进行干燥处理；
48.c)干燥后的dna样本进行pcr体系构建；优选的，每个反应仅需1μl反应体系，包括10ng dna、0.5μl kasp标记的扩增引物、2x master mix standard rox、0.014μl kasp-by-design assay mix、ddh2o补至1μl；
49.d)将加好反应体系的孔板进行封膜，并低速快速离心；
50.e)离心后进行水浴pcr，反应程序包括94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃退火1min(每一个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃变性20s，55℃退火1min，26-29个循环。
51.该实施方式的一些实施例中，所述步骤(3)中具体的操作步骤：将完成反应的孔板，吹干降温后在酶标仪pherastar上进行读板，采用snpviewer2软件对扫描数据进行分析，根据分析结果确定洋葱杂交种真实性和纯度。
52.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
53.实施例1
54.用于洋葱杂交种纯度鉴定引物的获得
55.依据genbank数据库中洋葱skp1-ms(genbank no.km065384.1)以及skp1-ms(genbank no.km065385.1)基因序列的snp突变位点信息，采用primer premier 5.0和primer 3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/input.htm)设计了14套特异性kasp标记引物组合，通过筛选最终确定了一组既准确又稳定的特异性引物组合，由两条上游引物(hi-ms、hi-ms)和一条下游引物(hi-c)组成，两条上游引物5'端连接有荧光标签序列，3'末端包含等位变异碱基c/g，用于扩增所述标记的引物核苷酸序列如序列表中seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。
56.seq id no.1(hi-ms)：下划线部分为fam荧光标签序列
57.gaaggtgaccaagttcatgc gaagaggttcgagaaatatttcatttac
58.seq id no.2(hi-ms)：下划线部分为hex荧光标签序列
59.gaaggtcggagtcaacgga gaagaggttcgagaaatatttcatttag
60.seq id no.3(hi-c)：
61.ctagaagctgtgtattgcatgaatgakata
62.两条上游引物5'端连接有荧光标签序列，3'末端包含等位变异碱基c/g，其中引物hi-ms的5'端连接fam荧光标签序列：
63.5'-gaaggtgaccaagttcatgc-3'；
64.引物hi-ms的5'端连接为h e x荧光标签序列：
65.5'-gaaggtcggagtcaacgga-3'。
66.上述引物序列由上海贝晶生物技术有限公司合成。
67.实施例2
68.基于snp分子标记鉴定洋葱雄性不育三系配套杂交种纯度的方法
69.(一)洋葱杂交种天正105、紫铃及其父本、母本种子基因组总dna的快速提取
70.供试两个洋葱杂交种各随机选择种子100粒左右，父母本各3-5粒作为样本群体。
71.(1)将1粒洋葱种子放入2ml离心管中，加入800μl tps缓冲液和5μlrnase，在组织破碎仪中破碎2min；
72.(2)80℃水浴加热30min，期间颠倒混匀2-3次；
73.(3)12,000rpm离心5min，取上清液至新的1.5ml无菌离心管中；
74.(4)加入等体积的异丙醇，充分混匀，12,000rpm离心5min，弃上清；
75.(5)加入600μl 70％乙醇，涡旋振荡5s，12,000rpm离心2min，弃上清；
76.(6)重复步骤(5)；
77.(7)打开离心管盖，室温倒置5～10min，彻底晾干残余的乙醇；
78.(8)加入20μl的无菌ddh2o，溶解dna沉淀，-20℃冻存备用。
79.(二)pcr扩增
80.1)用核苷酸序列如序列表中seq no.1、seq no.2和seq no.3所示的引物进行pcr反应。
81.2)将样本从96孔板中通过replikator转移至384孔板中，再最终转移至1536孔板中，确保样本dna终浓度约为10ng/μl；
82.3)将装有dna的1536孔板置于65℃烘箱中干燥30min；
83.4)干燥后的dna进行pcr体系构建，每个反应仅需1μl反应体系，包括10ng dna，0.5μl kasp 2x master mix standard rox(lcg genomics,teddington，middlesex,uk,beverly,ma,usa)and 0.014μl kasp-by-design assay mix(lgc genomics,beverly,ma,usa)，ddh2o补至1μl；
84.5)将加好反应体系的孔板进行封膜，并低速快速离心；
85.6)离心后进行水浴pcr，反应程序包括：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃退火1min(每一个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃变性20s，55℃退火1min，26-29个循环；
86.(三)读板及结果分析
87.pcr反应结束后，将完成反应的孔板，吹干降温后在酶标仪pherastar上进行读板，采用snpviewer2软件对扫描数据进行分析，根据分析结果鉴定洋葱杂交种的真实性和纯度，若待测dna扩增产物的荧光信号数据经snpviewer2分析后呈红色圆点标记，则该洋葱种子的细胞核基因型为隐形纯合的msms，为母本不育系的种子；若待测dna扩增产物的荧光信号呈黄色圆点标记，则该洋葱种子的细胞核基因型为显性纯合的msms，为父本自交系种子；若待测dna扩增产物的荧光信号呈绿色圆点标记，则该洋葱种子的基因型为杂合的msms，为真实的洋葱杂交种。若待测dna扩增产物的荧光信号数据经snpviewer2分析后呈粉色，则为无效结果。
88.采用实施例2的方法对两个洋葱杂交种抽样进行纯度鉴定，各随机选择种子100粒左右，提取种子的基因组总dna进行检测，检测结果全部为真杂交种，种子纯度为100％，与田间调查结果一致，准确率为100％，如图2所示。
89.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。