复方苦参注射液在促进自然杀伤细胞增殖和杀伤活性中的应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及复方苦参注射液在促进自然杀伤细胞增殖和杀伤活性中的应用。


背景技术：

2.自然杀伤细胞(natural killer cell，nk)是固有免疫和适应性免疫的重要效应淋巴细胞，激活的nk细胞与抗原提呈细胞、b细胞、t细胞共同发挥免疫防御作用，能够介导免疫反应，实现免疫监视功能，清除自身衰老细胞、感染细胞和肿瘤细胞。nk细胞与t细胞一样作为白血病过继免疫治疗的重要细胞，具有相似的细胞毒性作用，且nk细胞不具有mhc限制性，不需要抗原提呈细胞而可直接激活，对肿瘤细胞反应更快，免疫原性更低。
3.nk细胞杀伤肿瘤细胞主要是通过分泌杀伤性细胞因子和释放穿孔素和颗粒霉素b等细胞毒性物质，通过各种不同途径导致细胞死亡。
4.免疫治疗是血液恶性疾病的新型治疗方式，包括干细胞移植、抗体、免疫检查点抑制剂、过继免疫治疗和血液疫苗。nk细胞作为过继免疫治疗的重要组成成分，为了实现nk细胞的激活与编辑，nk细胞的体外培养是过继免疫治疗临床及科研的一种常用手段，在现有条件下，一般采用细胞因子刺激实现nk细胞的体外培养，常用细胞为il-2、il-15、il-21等。然而现有体外培养nk细胞的方法存在着对nk细胞扩增困难、活性不足、杀伤活性不强等问题。因此，如何在体外进行高效的nk细胞培养具有重大的临床意义。
5.复方苦参注射液(compound kushen injection,cki)是肿瘤化疗常用的辅助化疗药，其主要成分是苦参碱和氧化苦参碱，在我们前期研究中已证实复方苦参注射液具有抗氧化作用，通过ros途径诱导aml细胞凋亡。同时在临床研究中也已证实复方苦参注射液可以增加体内免疫球蛋白的分泌，与索拉菲尼联用可促进巨噬细胞和cd8+t细胞的免疫作用(jin y,yang q,liang l,ding l,liang y,zhang d,wu b,yang t,liu h,huang t,shen h,tu h,pan y,wei y,yang y,zhou f.compound kushen injection suppresses human acute myeloid leukaemia by regulating the prdxs/ros/trx1 signalling pathway.j exp clin cancer res.2018nov19；37(1):277.)，但是目前还没有报道过其对nk细胞增殖和杀伤活性的影响。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供复方苦参注射液在促进自然杀伤细胞增殖和杀伤活性中的应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.本发明发现在培养基中添加复方苦参注射液，能够使nk细胞的增殖速度快、活力好、凋亡率低、杀伤作用增强。基于此，复方苦参注射液具有促进nk细胞增殖和杀伤活性中的应用，复方苦参注射液具有制备促进nk细胞增殖和杀伤活性的培养基的应用。
9.进一步的，本发明还提供了一种促进nk细胞增殖和杀伤活性的培养基，所述的培养基含有复方苦参注射液。
10.在一些实施方案中，所述的培养基中复方苦参注射液的浓度为2.0-3.0μg/ml，优选为2.2μg/ml。
11.在一些实施方案中，所述的培养基以rpmi 1640为基础培养基。进一步地，所述的培养基含10％血清，所述的血清为自体血来源的血清，优选为脐血或外周血离心后灭活的血清。
12.进一步的，本发明还提供了一种nk细胞的培养方法，所述的培养方法采用的培养基为上述培养基。
13.本发明的优点和有益效果：本发明在培养基中添加复方苦参注射液，成功增敏了外周血来源的自然杀伤细胞。从细胞形态、分子表型、杀伤能力方面增敏nk细胞，而且具有增殖速度快、活力好、凋亡率低等优点。
14.本发明显著提高了体外培养nk细胞的活力、增殖与杀伤作用，改良了nk细胞的培养方法。
附图说明
15.图1：复方苦参注射液(cki)促进nk细胞的增殖。分别用含不同浓度cki的培养基培养nk细胞48h，发现低浓度的cki促进nk增殖，高浓度的cki抑制nk增殖，且cki浓度为2.2μg/ml时，nk细胞增殖最快。图中，ns：不显著(not significant)，*：p《0.05，**：p《0.01，***：p《0.001，****：p《0.0001，下同。
16.图2：nk细胞在cki刺激之后体积变小。在倒置显微镜镜下(
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100)，可以观察到含cki的培养基培养的nk细胞较空白对照(control)的nk细胞，体积变小，处于明显增殖状态；此外在流式细胞仪中，通过观察细胞大小分布的改变，进一步验证这一现象。
17.图3：cki对nk细胞凋亡作用。通过流式分析，可以观察到，含cki的培养基培养的nk细胞较空白对照组(control)早期凋亡率更低，晚期凋亡率和坏死率无明显统计学差别。
18.图4：cki增强nk细胞杀伤毒性。含cki的培养基培养后的nk细胞与空白对照组(control)nk细胞相比，cki刺激的nk细胞分泌tnf-α和ifn-γ水平明显升高(a)；将含cki的培养基培养的nk细胞和空白对照组(control)nk细胞，分别与thp-1细胞按5:1的比例共培养6h后，可以观察到：cki处理组nk细胞cd107a和穿孔素perforin的表达水平明显增高(b，c)，表明cki可以促进nk细胞活化。
具体实施方式
19.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
20.实施例1
21.本实施例提供复方苦参注射液对nk细胞促增殖和杀伤的效果验证。
22.一、实验方法
23.1.细胞培养
24.(1)抽取新鲜脐带血或健康人外周血低温保存，尽快送至实验室分离培养。
1500rpm10min离心得到自体血清，56℃30min灭活，再次1500rpm离心10min得到自体血清，用于配制培养基。
25.(2)将血液轻轻平铺至装有等体积的淋巴细胞分离液的15ml无菌离心管中，注意操作要尽可能轻柔、平稳。随后可观察到离心管中形成明显的两层，上层是血液，下层是淋巴细胞分离液。
26.(3)将离心管放入离心机，设定转速2500rpm，离心时间25min，离心后，此时离心管中由上至下分为四层。吸管将中间的白膜层轻轻吸出，用含2％fbs的pbs缓冲液反复洗涤2次。以1500rpm转速分别离心5min，弃上清后留单个核细胞(pbmc)沉淀。
27.(4)往rpmi 1640中加入10％灭活的自体血清配制成完全培养基。分离得到的pbmc用完全培养基重悬，调整密度为1
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106cell/ml，与灭活的k562饲养细胞按数量比5:1(pbmc:k562)加入24孔板中，每孔1ml液体，单独每孔补充1000u/ml的il-2和1mg/ml的il-15，在37℃富含co2的培养箱培养。三天后进行半量换液传代，同时补充il-2至1000u/ml，每隔三天进行半量换液传代，每次换液单独补充il-2，培养14-21天，期间用流式进行nk细胞纯度鉴定，至nk细胞纯度不低于70％。
28.二、细胞增殖及杀伤活性检测
29.将上述鉴定的nk细胞用完全培养基调整密度为1
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106cell/ml，接入t25培养瓶中，在37℃富含co2的培养箱继续培养后进行下述实验。
30.1.nk细胞增殖
31.将nk细胞用完全培养基重悬，按每孔1
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104个细胞/100μl加入到96孔板中，加入不同浓度梯度的复方苦参注射液，于37℃恒温培养48h后，用cck-8检测不同96孔板在450nm波长的吸光度，每组试验至少做三个复孔，计算细胞增殖率。
32.图1是nk细胞培养48h的增殖率，结果显示，培养基中复方苦参注射液的添加量为2.2μg/ml，nk细胞增殖效果最好。
33.2.nk细胞形态变化
34.将nk细胞用完全培养基重悬，按每孔1
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106个细胞/ml铺入6孔板，用含2.2μg/ml复方苦参注射液的完全培养基培养48h后，于高倍显微镜下观察，在100倍显微镜下可以观察到nk细胞体积变小，用流式细胞仪观察到同样的结果，如图2所示。
35.3.复方苦参注射液对nk细胞凋亡的影响
36.将nk细胞用完全培养基重悬，按每孔1
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106个细胞/ml铺入6孔板，用含2.2μg/ml复方苦参注射液的完全培养基培养48h后，收集细胞，用pbs洗涤细胞两次，收集细胞沉淀。采用annexin v-fitc/pi细胞凋亡试剂盒(南京凯基，cat#kga105-kga108)检测细胞凋亡情况。用500μl 1
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binding buffer缓冲液重悬细胞，加入5μl annexin-v fitc和10μl pi，避光室温孵育5min后，上机检测。通过流式细胞仪观察到nk细胞凋亡结果如图3所示。
37.4.复方苦参注射液增强nk细胞杀伤毒性
38.将nk细胞用完全培养基重悬，按每孔1
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104个细胞/100μl铺入96孔板，用含2.2μg/ml复方苦参注射液的完全培养基培养48h后，离心收集上清液，用elisa酶联免疫吸附法细胞因子检测试剂盒(tnf-α、ifn-γelisa试剂盒均购自北京达科为，批号分别是cat#1117202、cat#1110002)检测细胞因子水平，复方苦参注射液明显提高了nk细胞分泌细胞因子水平，如图4a所示。将用含2.2μg/ml复方苦参注射液的完全培养基培养48h后的nk细胞和
空白对照组(control)nk细胞，分别与thp-1细胞按5:1的比例共培养6h，离心收集细胞沉淀，用pbs洗涤后，用50μl pbs重悬，加入流式抗体cd3/cd56/perforin/cd107a各2μl，避光染色30min后，洗涤，重悬，上机，通过流式细胞仪观察到nk细胞杀伤相关指标结果如图4b、c所示。
39.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。