一种马铃薯抗虫基因StSOBIR1及其重组载体和应用

一种马铃薯抗虫基因stsobir1及其重组载体和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种马铃薯抗虫基因stsobir1及其重组载体和应用。


背景技术：

2.中国是世界上重要的马铃薯生产国，年均产量约8000多万吨，位列全球第一。2015年中国启动了马铃薯主粮化战略，马铃薯成为继水稻、小麦、玉米之后的第四大主粮。近年来，我国的马铃薯产业得到快速发展的同时，马铃薯的生产也面临着众多的挑战。目前，防控马铃薯害虫主要的方式是使用化学农药，化学农药在有效控制马铃薯害虫带来的产量损失、确保粮食安全方面发挥着不可或缺的作用。而化学农药在控制马铃薯害虫的同时，也对其天敌等有益生物产生负面作用，特别是其不科学使用会对人类健康和生态环境带来影响。科学合理使用化学农药，减少化学农药施用，寻找抗虫基因、利用植物自身的抗性控制虫害，对生产无公害马铃薯尤其重要，是我国农业的需求之一。
3.利用植物抗虫基因培育的抗虫转基因作物，可以抑制害虫种群，从而使植物具有更强的抗虫性，还具有成本低、保护全、特异性强等优点，已经成为当前农业生物工程研究的一个热点。常规的抗虫转基因作物主要基于抗虫蛋白的杀虫活性，而植物本身存在众多应对害虫的抗虫调控基因，这些基因编码的蛋白能调控植物体内抗虫物质(如抗虫化合物和抗虫蛋白等)的合成和累积，从而提高植物对害虫的抗性，目前，这类抗虫调控基因再植物抗虫育种中的运用相对较少。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种马铃薯抗虫基因stsobir1及其重组载体和应用。
5.一种马铃薯抗虫基因stsobir1，具有负调控马铃薯抗虫性的功能，所述的马铃薯抗虫基因stsobir1碱基序列如seq id no:1所示，由2169个核苷酸组成；
6.或，与seq id no:1所示碱基序列同源性在95％以上的基因。
7.一种马铃薯抗虫基因stsobir1编码的蛋白质，具有负调控马铃薯抗虫性的功能，所述的马铃薯抗虫基因stsobir1编码的蛋白质氨基酸序列如seq id no:2所示，该蛋白在植物中的表达量和/或活性越低，则植物的抗虫性越强。
8.一种重组载体，所述重组载体包含seq id no:1中第930-1179位核苷酸的反向互补序列。
9.上述重组载体的制备方法为：在phellsgate8载体的两个xhol、xbal位点分两步分别发生双酶切反应，并分别插入seq id no:1中第930-1179位核苷酸的反向互补序列，所述的反向互补序列如seq id no:3和seq id no:4所示，得到重组载体。
10.上述重组载体在制备抗虫转基因马铃薯中的应用，该重组载体能用于植物遗传转化。
11.一种提高马铃薯抗虫性的方法：对受体植物中的马铃薯抗虫基因stsobir1进行抑
制表达，使植物中由马铃薯抗虫基因stsobir1编码的蛋白的表达量和/或活性降低，获得抗虫植物；
12.作为本发明的实施方式，在受体植物中导入rnai干扰载体，所述的rnai干扰载体为包含seq id no:1中第930-1179位核苷酸的反向互补序列的重组载体，所述的重组载体能够抑制受体植物中的马铃薯抗虫基因stsobir1的表达。
13.在受体植物中导入rnai干扰载体的方法包括：使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
14.一种马铃薯抗虫基因stsobir1的克隆方法，包括如下步骤：
15.马铃薯cdna文库的构建：选取马铃薯叶片提取总rna，以总rna为模板，在反转录酶的作用下合成cdna；
16.以上述cdna为模板，运用引物进行pcr扩增，获得马铃薯抗虫基因stsobir1片段；
17.上述扩增片段回收后连入克隆载体，测序后获得seq id no:1所示的马铃薯抗虫基因stsobir1。
18.本发明具备的有益效果是：本发明是通过抑制马铃薯中抗虫基因stsobir1的表达水平来实现马铃薯对咀嚼式昆虫的抗性。实验证明，stsobir1基因沉默的转基因马铃薯上害虫的个体大小和/或重量小于野生型马铃薯，stsobir1基因沉默的转基因马铃薯的重要抗虫次生代谢物α-solanine和α-chaconine含量显著高于野生型马铃薯。stsobir1基因沉默的转基因马铃薯在受到马铃薯块茎蛾侵害时，其对马铃薯块茎蛾的抗性显著提高。因此，马铃薯抗虫基因stsobir1与马铃薯对马铃薯块茎蛾抗性相关。
附图说明
19.图1为stsobir1基因沉默的马铃薯株系地上部分表型结果。
20.图2为stsobir1基因沉默的马铃薯株系在饲喂马铃薯块茎蛾10天后马铃薯块茎蛾的体重统计结果。
21.图3为stsobir1基因沉默的马铃薯株系在模拟虫害处理48小时后抗虫次生代谢物茄碱含量统计结果，a为α-solanine含量；b为α-chaconine含量。
22.具体实施方法
23.下面通过具体实施例对本发明做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
24.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
25.下述实施例中马铃薯采用马铃薯品种e3(以下也称为野生型马铃薯)。
26.实施例1、抑制stsobir1基因表达的重组载体的获得：
27.1.引物的设计与合成
28.本发明设计上游引物stsobir1-qf1：5'-tcttacaatgcagccaacca-3'；下游引物stsobir1-qr1：5'-tgcagtaaacatacaagatttgaca-3'；上游引物stsobir1-qf2：5'-tttggagaggacacgctcgagtaacaagaagaaaaggaagttaagatcttg-3'；下游引物stsobir1-qr2：5'-tggggtaccgaattcctcgagtccacatccaccttttccaatc-3'；上游引物stsobir1-qf3：5'-gataagctt
ggatcctctagataacaagaagaaaaggaagttaagatcttg-3'；下游引物stsobir1-qr3：5'-tcattaaagcaggactctagatccacatccaccttttccaatc-3'。
29.上下游引物2和3均在引物两段分别引入xhol和xbal酶切位点，引物由生物公司合成。
30.2.pcr方法获得stsobir1基因片段
31.根据蛋白磷酸化数据库中提供的蛋白序列id，在ncbi官网中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找到该基因核酸序列(id为loc102583521)，用primer-blast设计引物1，引物包含该基因cds区域全长。本发明合成以高质量gdna双链为模板，利用上游引物stsobir1-qf1和下游引物stsobir1-qr1扩增stsobir1序列。pcr条件为：
①
94℃，10min；
②
94℃，30s；55℃，30s；72℃，100s；35个循环；
③
72℃，10min。
32.3.克隆鉴定与序列测定
33.扩增片段用1％琼脂糖凝胶电泳120v，30min检测产物，采用商业化凝胶回收试剂盒回收后，用超微量分光光度计检测回收产物浓度。用dh5α感受态细胞连接转化，再用m13引物对菌液进行pcr验证，再次用1％琼脂糖凝胶电泳120v，30min检测产物，并将含目的条带的菌液送至测序公司进行测序。最后利用geneious软件与ncbi结果进行比对，无误后保存质粒。本发明通过核苷酸序列测定分析，最终获得马铃薯抗虫基因stsobir1，核苷酸序列如seq id no:1所示，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
34.4.载体构建
35.以上述pcr产物为模板，分别利用stsobir1-qf2、stsobir1-qr2和stsobir1-qf3、stsobir1-qr3 pcr扩增stsobir1序列片段，条件同上，得到两段250bp反向互补的pcr片段，如seq id no:3、seq id no:4所示。
36.先以限制性内切酶xho i双酶切phellsgate8载体上的两个xho i位点，利用商业化连接转化试剂盒将酶切产物与pcr产物seq id no:3重组连接，进行序列测定验证重组连接效果。再以限制性内切酶xba i双酶切重组产物上的两个xba i位点，利用商业化连接转化试剂盒将酶切产物与pcr产物seq id no:4重组连接，进行序列测定验证重组连接效果，获得植物重组载体。
37.本发明所述stsobir1基因及其重组载体能用于植物遗传转化，在培育提高抗逆性植物中的应用。
38.实施例2、stsobir1基因沉默马铃薯株系的构建及功能鉴定
39.一、stsobir1基因沉默马铃薯株系的构建
40.将马铃薯块茎消毒，播种于1/2ms培养基中暗培养至发芽，然后转入光照条件培养6-8天，取无菌苗子叶，预培养两天。以实施例1中获得的植物重组载体利用冻融法转化农杆菌，获得重组农杆菌，并经pcr鉴定得到阳性转化子(含有seq id no:1所示的stsobir1基因的转化子)，用于侵染马铃薯无菌苗子叶；本实施例中用在含50mg/l的卡那霉素培养基上活化的农杆菌侵染无菌苗子叶。暗培养2天，转入筛选培养基，2周继代一次，直至出现绿色芽点，再将抗性芽转入生根培养基，光照培养，2-3周生根后剪取再生植株叶片，pcr检验。pcr条件为：
①
94℃，3min；
②
94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；30个循环；
③
72℃，10min；
④
25℃，1min。
41.二、phellsgate8-stsobir1-rnai的转基因马铃薯对昆虫抗性影响
42.在昆虫饲喂前，将野生型马铃薯和phellsgate8-stsobir1-rnai的转基因马铃薯在常规条件下培养：光照16h，黑暗8h，相对湿度55
±
10％，温度为22℃。待植物长至3周时，用毛笔取马铃薯块茎蛾初孵幼虫接至植物上，任其自由生长，每株系取5～6株植物进行实验，每株植物接10头左右马铃薯块茎蛾初孵幼虫。待生长至第10天时，对植株进行拍照记录，同时拍照记录马铃薯块茎蛾的生长状况并称重。
43.实验结果表明，与野生型马铃薯e3相比，取食的转基因马铃薯的马铃薯块茎蛾体重更轻，且α-solanine和α-chaconine含量显著高于野生型马铃薯，说明的转基因马铃薯对马铃薯的抗性显著提高。具体表现为：
44.(1)phellsgate8-stsobir1-rnai的转基因马铃薯植株生长至21天后，对植物进行拍照记录。
45.结果如图1所示，phellsgate8-stsobir1-rnai的转基因马铃薯与对照的野生型马铃薯e3的植株表现相同。
46.(2)马铃薯块茎蛾喂养到第10天，对饲喂相应植株的马铃薯块茎蛾做重量统计。
47.结果如图2所示，将初孵幼虫接到相应植株并饲喂10天后，取食转基因马铃薯的块茎蛾的重量显著低于取食野生型马铃薯e3的马铃薯块茎蛾。
48.(3)phellsgate8-stsobir1-rnai的转基因马铃薯植株生长至21天后，用灭菌滚轮平行主脉方向在叶子上划出左右各两道伤口，将提取好的块茎蛾口腔分泌物5倍稀释液用枪头吸取20μl均匀涂抹在伤口上，每次只处理羽状复叶前三张叶片，48小时后收集叶片，并检测α-solanine和α-chaconine含量。
49.结果如图3所示，phellsgate8-stsobir1-rnai的转基因马铃薯的α-solanine和α-chaconine含量显著高于野生型马铃薯。
50.上述结果证明，马铃薯抗虫基因stsobir1与马铃薯对马铃薯块茎蛾抗性相关，由马铃薯抗虫基因stsobir1编码的蛋白及其编码基因将可用于利用转基因技术改良作物抗虫性的研究和产业化生产中。
51.最后说明，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但是若在形式和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。