一株巨大芽孢杆菌及其制备的微生物菌剂、马铃薯专用肥和应用的制作方法

1.本发明属于微生物学及其农业应用技术领域，尤其涉及一株巨大芽孢杆菌及其制备的微生物菌剂、马铃薯专用肥和应用。


背景技术：

2.马铃薯以其耐旱、耐瘠薄、高产高效、适应性广、营养成分全而丰富、产业链长等优点倍受人们的青睐和重视。近年来，我国的马铃薯种植面积也呈不断上升的趋势，已成为世界上马铃薯种植面积最大的国家，占全球种植面积的20％以上，占亚洲的70％左右。马铃薯在我国既是粮菜兼用作物，又是重要的经济作物，具有适应性强、产量高、加工链长的特点，在提供营养全面食品、保障粮食安全、帮助农民脱贫致富等方面发挥着巨大的作用。
3.在马铃薯的种植过程中，科学合理的施肥是高产、优质、高效马铃薯生产的重要方面。但是在马铃薯传统种植过程中，农民长期偏施氮肥、不施或少施磷钾肥，导致土壤结构破坏和肥力降低，肥料利用率持续下降，严重制约着马铃薯产业的可持续发展，并已对国家粮食安全构成了严重的威胁。所以目前亟需一种高效提质增产基础上，还可改良土壤、丰富土壤微生物数量等的有机马铃薯专用肥。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明提供了一株巨大芽孢杆菌及其制备的微生物菌剂、马铃薯专用肥和应用。本发明从内蒙古农业大学职业技术学院田间示范试验基地马铃薯田马铃薯根际土壤样品中分离筛选获得1株芽孢杆菌菌株，通过形态学、生理生化特征及基因序列分析鉴定了其分类地位，将其确定为巨大芽孢杆菌，并进行了保藏，保藏号为cgmcc no.24987。本发明使用该巨大芽孢杆菌制成微生物菌剂，进一步与元泰丰固体有机肥混合制成一种马铃薯专用肥，该马铃薯专用肥应用于马铃薯的种植中，具有显著提质增产、改良土壤、丰富土壤微生物数量等作用，对马铃薯种植，尤其是盐碱土的马铃薯种植具有重大意义。
5.为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
6.本发明提供了一株巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)，其保藏号为cgmcc no.24987。
7.本发明还提供了一种含有所述巨大芽孢杆菌的微生物菌剂。
8.优选的，所述微生物菌剂中巨大芽孢杆菌的有效活菌数≥5.0亿/g。
9.本发明还提供了一种所述微生物菌剂制成的马铃薯专用肥，所述马铃薯专用肥中还包括元泰丰固体有机肥，所述元泰丰固体有机肥的商品名为碳能，生产商为元泰丰(包头)生物科技有限公司，货号为y010403008。
10.优选的，所述微生物菌剂为液体，微生物菌剂与元泰丰固体有机肥的混合比例为体积：重量为1l:100kg。
11.本发明还提供了一种所述巨大芽孢杆菌或所述微生物菌剂或所述马铃薯专用肥在马铃薯种植中的应用。
12.本发明还提供了一种所述巨大芽孢杆菌或所述微生物菌剂或所述马铃薯专用肥在盐碱土马铃薯种植中的应用。
13.与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
14.(1)施用本发明中的马铃薯专用肥较单施用化肥，在马铃薯增产方面，可将马铃薯的干物质占比显著提升33.3％，产量增产37.2％；在土壤改良方面，能够有效提升土壤有机质含量，同时也增加了土壤中n、p、k总养分含量；在土壤微生物改善方面，可将土壤中的微生物总数增加近2倍，丰富微生物作用显著。
15.(2)本发明对盐碱地的马铃薯有较好的增产效果，同时可以丰富土壤微生物数量，提高盐碱地土壤有机质含量。用作专用肥，可显著提高作物抗逆性，提高马铃薯抵御不良环境的能力。
16.保藏证明说明：
17.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
18.保藏编号：cgmcc no.24987；
19.保藏日期：2022年05月30日；
20.保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
21.分类学命名：巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)。
附图说明
22.图1为本发明实施例1中巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)的形态图；
23.图2为本发明实施例1中巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)的系统发育树。
具体实施方式
24.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。
25.下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。
26.实施例1菌株的分离与鉴定
27.1.菌株采集与室内筛选
28.试验材料
29.na培养基(g/l)：na培养基粉33g，加蒸馏水至1l，ph 7.2～7.4。
30.试验方案
31.2021年12月15日从内蒙古农业大学职业技术学院田间示范试验基地的马铃薯田收集马铃薯根际土壤，使用稀释涂布平板的方法。将土样进行20天自然风干处理，取10g预处理土壤加入三角瓶瓶，加入95ml无菌水充分混匀后，摇床上振荡200rpm 30min，充分混匀非稀释为10-1，10-2、10-3、10-4共四个派度梯度。分别取100μl稀释液用涂布桥在倒好的na培养基上涂布平板。将涂布后的平板倒置于37℃的培养箱内培养，待产生明显的单菌落后，
挑单菌落划线纯化并保存菌种。
32.2.菌株生理生化试验鉴定
33.通过革兰氏染色观察分离菌株的形态，生理生化试验依据《常见细菌系统鉴定手册》进行，包括糖发酵实验，亚硝酸还原、明胶液化、牛奶胨化、淀粉水解、氧化酶、接触酶、耐盐性和需盐性检测。
34.结果显示：该菌株g
+
，长杆状，不运动，发酵乳糖产酸产气，能够使牛奶胨化，可使凝胶液化，能够分解淀粉，硝酸还原试验阴性，氧化酶实验阳性，其最适nacl浓度为4％，符合巨大芽孢杆菌的生理生化特点。
35.3、菌株的分子生物学鉴定
36.巨大芽孢杆菌dna提取具体步骤参照takara minibest dna fragment purification kit ver.4.0(宝生物工程(大连)有限公司)操作说明书。以基因组dna为模板，利用16srdna基因通用引物对菌株的基因组进行pcr扩增，其中引物为27f和1492r，具体序列如seqidno.1～seqidno.2所示。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物长度，将扩增产物及时送往荣旭生物科技(上海)有限公司测定基因序列。测序结果用bioedit软件进行序列拼接，将拼接结果在blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)利用blastnsuite软件进行同源性比较，之后在genbank数据库中查找模式菌株序列并下载。以bioedit进行多序列比对后，用系统发育分析软件mega*(molecularevolutionarygeneticsanalysis)x运行相关文件，执行邻近算法(neighbor-joining)构建系统发育树。拼接序列如seqidno.3所示，系统发育树如图2所示。
37.seq id no.1：27f(5
′‑
agagtttgatcctggctcag-3
′
)；
38.seq id no.2：1492r(5
′‑
ggttaccttgttacgactt-3
′
)；
39.seq id no.3：16s rdna序列
40.ccttaggcggctagctccttacggttactccaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggttttatgggattggcttgacctcgcggtcttgcagccctttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactaaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtcccccgaaggggaacgctctatctctagagttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacagaccaaaaagccgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccgcttttctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccacggttgagccgtgggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgcgcgctttacgcccaataattccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtacgagcagttactctcgtacttgttcttccctaacaacagagttttacgacccgaaagccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctatgcatcgttgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcaccgcgggcccatctgtaagtgatagccgaaaccatctttcaatcatctcc
catgaaggagaagatcctatccggtattagcttcggtttcccgaagttatcccagtcttacaggcaggttgcccacgtgttactcacccgtccgccgctaacgtcatagaagcaagcttctaatcagttc
41.根据比对结果可推断采集菌株为巨大芽孢杆菌。
42.实施例2普通土壤肥效验证
43.试验地为内蒙古包头市土默特右旗内蒙古农业大学职业技术学院田间示范试验基地，采取马铃薯连作模式。共设4个处理，试验a、b、c组和对照组，3次重复，共计12个小区，每个小区面积7m
×
8m＝56m2。试验周期5个月。
44.对照组仅施化肥，化肥中氮磷钾比例为n:p2o5:k2o＝18:10:15。试验a组施用巨大芽孢杆菌菌剂(液体)与元泰丰固体有机肥体积与质量比为1l:100kg比例混合的马铃薯专用肥，有效活菌数≥5亿/g。试验b组施用化肥(氮磷钾比例为n:p2o5:k2o＝18:10:15)和巨大芽孢杆菌菌剂(液体)混合，比例为1l:100kg，有效活菌数≥5亿/g。试验c组施用元泰丰固体有机肥(商品名：碳能，生产商：元泰丰(包头)生物科技有限公司，货号：y010403008)。其余田间管理措施相同。
45.微生物总数使用恒温振荡培养箱、电子天平等仪器，根据《ny/t2321-2013微生物肥料产品检验规程》方法检测，其余试验材料和方法使用常规材料和方法即可。
46.通过对马铃薯生长相关指标、土壤有机质和养分、土壤中微生物变化情况的指标进行检测分析，得到的结果如表1所示。
47.表1田间试验结果
[0048][0049]
由表1可知：施用本发明中的马铃薯专用肥较单独施用化肥、单独施用元泰丰固体有机肥以及同时使用化肥和菌剂相比，在各个性能指标的改善提升方面的效果都最好，其中在马铃薯增产方面，可将马铃薯的干物质占比平均提升了37.56％，产量平均增产36.18％；在土壤改良方面，能够有效提升土壤有机质含量，同时也增加了土壤中n、p、k总养分含量；在土壤微生物改善方面，可将土壤中的微生物总数平均增加近2倍，丰富微生物作用显著。
[0050]
综上可知：本发明的马铃薯专用肥对盐碱地的马铃薯有较好的增产效果，同时可以丰富土壤微生物数量，提高盐碱地土壤有机质含量。用作专用肥，可显著提高作物抗逆性，提高马铃薯抵御不良环境的能力。对马铃薯种植，尤其是盐碱土的马铃薯种植具有重大意义。
[0051]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。