感知真菌信息素的重组酿酒酵母菌的构建方法及生物传感器

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种感知真菌信息素的重组酿酒酵母菌的构建方法及生物传感器。


背景技术：

2.在真核生物中，细胞外信号的感知以及细胞内信号转导的主要信号通路包括g蛋白偶联受体系统(gpcr)，gpcr系统能够识别细胞环境中的各种信号，因此gpcr是基础研究和生物医学应用研究界的热点。酿酒酵母中的gpcr系统主要包括信息素和糖感知，酿酒酵母信息素途径与其他真核细胞信号转导系统具有相似性，使得酿酒酵母信息素gpcr系统被广泛应用于表征真菌以及高级真核生物中的异源gpcr。利用酵母这一系统已经验证了许多异源表达的gpcr以及构建了多种基于酵母的生物传感器，用于化合物、激素、神经递质、细胞代谢物以及交配信息的检测与感知。当酿酒酵母异源表达真菌病原体的gpcr，即可感知真菌信息素从而达到特异性检测病原体。
3.真菌物种中，交配信息素在真菌交配活动的发展中发挥重要作用。两个真菌细胞是否发生交配取决于两个细胞是否为不同的交配型。以酿酒酵母为例，两种不同的交配型细胞mata和matα分别分泌a和α信息素，a信息素被matα细胞表面的gpcr-ste3识别，而α信息素被mata细胞表面的gpcr-ste2感知，继而发生细胞融合交配(jones,s.k.,jr.；bennett,r.j.,fungal mating pheromones:choreographing the dating game.fungal genet biol.2011,48(7),668-76)。而致病性真菌物种同样会产生相应的交配信息素。
4.相关技术中，一种基于酿酒酵母gpcr系统检测致病性真菌已在概念水平得到验证(ostrov,n.,et al.,a modular yeast biosensor for low-cost point-of-care pathogen detection.sci adv 2017,3(6),e1603221)。其通过异源表达gpcr检测信息素与易于读取的显色反应(胡萝卜素合成)相结合，实现了真菌信息素在纳摩尔范围内的检测。但其相关的信号存在一定的基本表达以及输出需要一定的前体化合物积累，即其存在一定的背景信号以及相应的输出信号不足等情况。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种感知真菌信息素的重组酿酒酵母菌的构建方法。该重组菌株可感知病原体真菌信息素并以绿色荧光蛋白作为输出信号，具有低渗漏、较高的信噪比等特点，具有良好的真菌生物监测应用前景。
6.为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种感知真菌信息素的重组酿酒酵母菌的构建方法，其包括：
7.pcr扩增获取基因编辑技术的grna表达片段：gfar1cds、ggal80cds和ggal4pr，将grna表达片段分别与表达载体p426-snr52-gga连接，得到重组质粒p426-gfar1cds、重组质粒p426-ggal80cds和重组质粒p426-ggal4pr；
8.将所述重组质粒p426-gfar1cds、所述重组质粒p426-ggal80cds和所述重组质粒p426-ggal4pr与其对应的基因编辑整合片段电转化入酿酒酵母感受态细胞，得到重组菌株；
9.向所述重组菌株中导入重组质粒p425gal1-egfp和真菌信息素受体的重组质粒，以便获得感知真菌信息素的重组酿酒酵母菌。
10.根据本发明实施例的一种感知真菌信息素的重组酿酒酵母菌的构建方法，该方法将酿酒酵母菌株中丝氨酸/苏氨酸细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂far1、半乳糖诱导系统的负调节因子gal80、内源gpcr受体ste2敲除，并将半乳糖诱导系统转录激活因子gal4的启动子替换为酵母信息素响应基因prm2的启动子；上述基因编辑后的菌株进一步采用持续性tef2启动子驱动异源表达病原体真菌信息素gpcr受体和半乳糖启动子gal1驱动的绿色荧光蛋白egfp，上述重组菌株通过异源表达真菌信息素，例如白色念珠菌信息素受体ste2能够特异性地识别白色念珠菌α因子信息素，并在感知低浓度信息素后产生强烈的绿色荧光蛋白信号。该检测系统具有低渗漏、较高的信噪比等特点，可作为检测病原体真菌的生物传感器。
11.另外，根据本发明上述实施例提出的感知真菌信息素的重组酿酒酵母菌的构建方法，还可以具有如下附加的技术特征：
12.可选地，所述真菌信息素受体为白色念珠菌α因子信息素受体caste2。
13.进一步地，以白色念珠菌atcc90028基因组为模板，以核苷酸序列如seq id no:18所示的caste2_f和核苷酸序列如seq id no:19所示的caste2_r为上下游引物，经pcr扩增得到caste2基因；再将caste2基因片段用bamhi和xhoi酶切，随后连接进入经过bamhi和xhoi双酶切的表达载体p416tef2，得到载体p416tef2-caste2。
14.进一步地，所述重组质粒p425gal1-egfp是以载体pk127为模板，以核苷酸序列如seq id no:20所示的egfp_f和核苷酸序列如seq id no:21所示的egfp_r为上下游引物，经pcr扩增得到egfp基因，将egfp基因片段用bamhi和xhoi酶切，随后连接进入经过bamhi和xhoi双酶切的表达载体p425gal1。
15.进一步地，将所述重组质粒p426-gfar1cds和基因编辑整合片段δfar1电转化入酿酒酵母感受态细胞，通过pcr鉴定获得阳性单克隆，阳性单克隆经5-氟乳清酸筛选去除grna表达载体，得到重组菌株cen.pk2-1cδfar1；将所述重组质粒p426-ggal80cds和基因编辑整合片段δgal80电转化入cen.pk2-1cδfar1感受态细胞，通过pcr鉴定获得阳性单克隆，阳性单克隆经5-氟乳清酸筛选去除grna表达载体，得到重组菌株js-ste-1；将所述重组质粒p426-ggal4pr和基因编辑整合片段δgal4pr:prm2pr电转化入js-ste-1感受态细胞，通过pcr鉴定获得阳性单克隆，阳性单克隆经5-氟乳清酸筛选去除grna表达载体，经传代培养去除cas9表达载体，得到重组菌株js-ste-p1。
16.进一步地，还包括重组质粒p426-gste2cds，所述重组质粒p426-gste2cds是以p426-snr52-grna载体为模板，以核苷酸序列如seq id no:2所示的r_sup4和核苷酸序列如seq id no:7所示的f_sp.gste2cds为引物，经pcr扩增得到gste2cds条带，将目的条带经过dna纯化试剂盒回收，得到胶回收产物；将胶回收产物与表达载体p426-snr52-gga连接
17.进一步地，将重组质粒p426-gste2cds和基因编辑整合片段δste2电转化转入已转入cas9的酿酒酵母js-ste-p1感受态细胞，通过pcr鉴定获得阳性单克隆，阳性单克隆经
5-氟乳清酸筛选去除grna表达载体，经传代培养去除cas9表达载体，得到重组菌株js-ste-p1c。
18.进一步地，将重组质粒p416tef2-caste2、p425gal1-egfp电转化转入酿酒酵母js-ste-p1c感受态细胞，获取重组菌株jsd-ste-p1c。
19.在本发明的第二个方面，本发明提出由上述的构建方法构建得到的感知真菌信息素的重组酿酒酵母菌。
20.根据本发明实施例的重组酿酒酵母菌，可感知病原体真菌信息素并以绿色荧光蛋白作为输出信号，具有低渗漏、较高的信噪比等特点，具有良好的真菌生物监测应用前景。
21.在本发明的第三个方面，本发明提出包括上述重组酿酒酵母菌的生物传感器。
22.根据本发明实施例的生物传感器，可感知病原体真菌信息素并以绿色荧光蛋白作为输出信号，具有低渗漏、较高的信噪比等特点，具有良好的真菌生物监测应用前景。
23.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
24.图1为根据本发明实施例的酿酒酵母mata细胞gpcr信号传导通路；
25.图2为根据本发明实施例的重组酵母菌感知病原体真菌α信息素的信号传导通路；
26.图3为根据本发明实施例的不同信息素启动子偶联半乳糖系统的菌株性能对比；
27.图4为根据本发明实施例的不同重组菌株感知白色念珠菌信息素剂量反应曲线。
具体实施方式
28.以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
29.为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
30.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得；涉及的实验如无特别说明，均为常规实验方法。
31.所用材料来源：酿酒酵母cen.pk2-1c和top10为市售，其中top10菌株用于载体构建。酿酒酵母表达载体p425gal1、p416tef2和p426snr52-gga为市售。phusion高保真dna聚合酶、限制性内切酶购买自厦门鹭隆生物科技发展有限公司。质粒提取试剂盒、dna纯化试剂盒、胶回收试剂盒和基因组dna提取试剂盒购买自杭州博日生物。白色念珠菌α信号肽由南京金斯瑞定制合成。
32.lb培养基组成为：10g
·
l-1
胰蛋白胨、5g
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l-1
酵母提取物、10g
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l-1
nacl，双蒸水补
齐至1l，0.1mpa压力121℃下灭菌20min。
33.ypd培养基组成为：10g
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l-1
酵母提取物、20g
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l-1
蛋白胨、20g
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l-1
葡萄糖，双蒸水补齐至1l，0.1mpa压力121℃下灭菌20min。
34.ynbd-leu培养基组成为：6.7g
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l-1
酵母氮源基础、1.4g
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l-1
酵母营养缺陷型培养基补充剂(不含亮氨酸)、20g
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l-1
d-葡萄糖，双蒸水补齐至1l，0.1mpa压力121℃下灭菌15min。
35.ynbd-trp-ura培养基组成为：6.7g
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酵母氮源基础、1.4g
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酵母营养缺陷型培养基补充剂(不含色氨酸和尿嘧啶)、20g
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d-葡萄糖，双蒸水补齐至1l，0.1mpa压力121℃下灭菌15min。
36.ynbd-leu-ura培养基组成为：6.7g
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酵母氮源基础、1.4g
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酵母营养缺陷型培养基补充剂(不含亮氨酸和尿嘧啶)、20g
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d-葡萄糖，双蒸水补齐至1l，0.1mpa压力121℃下灭菌15min。
37.100x 5-氟乳清酸：100mg 5-氟乳清酸使用dmso定溶于1ml。
38.本技术的酿酒酵母gpcr信号传导通路见图1：
39.当酿酒酵母mata细胞gpcr-ste2感知到α因子信息素后，发生g蛋白结构变化，从而激活mapk信号传导途径，继而mapk激酶fus3和kss1磷酸化下游基因，其中ste12为信息素通路关键转录因子，far1蛋白为交配过程的多功能调节剂，其介导交配中的细胞周期停滞。ste12转录因子依赖的信息素诱导基因包括交配途径的正作用成分(ste2、fus3、far1)、途径的负反馈调节因子(sst2、gpa1)和参与细胞融合过程的基因(例如fus1、prm2)。其中下游基因fus1的启动子因其受到ste12的强烈诱导得到广泛应用。而prm2诱导被认为需要ste12和kar4的协同作用，且其具有一定的延时表达效果。
40.为避免感知信息素后细胞周期停滞以及去除半乳糖负调节作用，本技术以酿酒酵母cen.pk2-1c为出发菌株，敲除far1和gal80得到js-ste-1菌株。为了实现gpcr系统与半乳糖诱导系统的偶联，将gal4启动子敲除替换为fus1pr或prm2pr，分别得到js-ste-f1和js-ste-p1，起始菌株和重组菌株转化egfp表达质粒后发现，js-ste-f1存在较大背景信号，具体数据见图3，因此fus1版本菌株不适用于病原体真菌的生物传感器的构建。最后在js-ste-p1中敲除酿酒酵母内源ste2，获得js-ste-p1c，并在此菌株基础上转化半乳糖诱导启动子gal1驱动绿色荧光蛋白egfp作为信号输出模块，同时持续性tef2启动子驱动异源表达不同病原体真菌信息素受体ste2，即可得到一系列可感知病原体真菌信息素并以绿色荧光蛋白作为输出信号的酿酒酵母菌株jsd-ste-p1c。
41.表1pcr扩增所用引物
42.43.[0044][0045]
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
[0046]
实施例1构建crispr的grna表达模块
[0047]
以p426-snr52-grna载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如seq id no:2所示的r_sup4和核苷酸序列如seq id no:4所示的f_sp.gfar1cds为引物(表1)，经pcr扩增得到gfar1条带，将目的条带经过dna纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。pcr扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。使用neb golden gate组装试剂盒，参照neb golden gate assembly protocol，将胶回收产物与表达载体p426-snr52-gga连接反应后转入大肠杆菌top10感受态细胞中，用核苷酸序列如seq id no:1和seq id no:2引物验证获取阳性克隆菌落，提取grna表达质粒p426-gfar1cds，并使用seq id no:3测序，测序结果与设计的质粒dna序列完全一致。
[0048]
以p426-snr52-grna载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如seq id no:2所示的r_sup4和核苷酸序列如seq id no:5所示的f_sp.ggal80cds为引物(表1)，经pcr扩增得到ggal80cds条带，将目的条带经过dna纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。pcr扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。使用neb golden gate组装试剂盒，参照neb golden gate assembly protocol，将胶回收产物与表达载体p426-snr52-gga连接，反应技术后转入大肠杆菌top10感受态细胞中，用核苷酸序列如seq id no:1和seq id no:2引物验证获取阳性克隆菌落，提取grna表达质粒p426-ggal80 cds，并使用seq id no:3测序，测序结果与设计的质粒dna序列完全一致。
[0049]
以p426-snr52-grna载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如seq id no:2所示的r_sup4和核苷酸序列如seq id no:6所示的f_sp.ggal4pr为引物(表1)，经pcr扩增得到ggal4pr条带，将目的条带经过dna纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。pcr扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。使用neb golden gate组装试剂盒，参照neb golden gate assembly protocol，将胶回收产物与表达载体p426-snr52-gga连接，反应技术后转入大肠杆菌top10感受态细胞中，用核苷酸序列如seq id no:1和seq id no:2引物验证获取阳性克隆菌落，提取grna表达质粒p426-ggal4pr(pr指靶向基因启动子区域)，并使用seq id no:3测序，测序结果与设计的质粒dna序列完全一致。
[0050]
以p426-snr52-grna载体(addgene#43803)为模板，以核苷酸序列如seq id no:2所示的r_sup4和核苷酸序列如seq id no:7所示的f_sp.gste2cds为引物(表1)，经pcr扩增得到gste2cds条带，将目的条带经过dna纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。pcr扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。使用neb golden gate组装试剂盒，参照neb golden gate assembly protocol，将胶回收产物与表达载体p426-snr52-gga连接，反应技术后转入大肠杆菌top10感受态细胞中，用核苷酸序列如seq id no:1和seq id no:2引物验证获取阳性克隆菌落，提取grna表达质粒p426-gste2cds，并使用seq id no:3测序，测序结果与设计的质粒dna序列完全一致。
[0051]
实施例2获取基因编辑整合片段
[0052]
以核苷酸序列如seq id no:8所示的far1_del_f和核苷酸序列如seq id no:9所示的far1_del_r为引物(表1)，经pcr扩增得到far1敲除整合片段，pcr扩增条件为：94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。
[0053]
以核苷酸序列如seq id no:10所示的gal80_del_f和核苷酸序列如seq id no:11所示的gal80_del_r为引物(表1)，经pcr扩增得到gal80敲除整合片段，pcr扩增条件为：94℃2min，98℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。
[0054]
以核苷酸序列如seq id no:16所示的ste2_del_f和核苷酸序列如seq id no:17所示的ste2_del_r为引物(表1)，经pcr扩增得到ste2敲除整合片段，pcr扩增条件为：94℃2min，94℃15s，50℃15s，72℃15s，循环30次；72℃1min。
[0055]
以酿酒酵母cen.pk2-1c基因组为模板，以核苷酸序列如seq id no:12所示的gal4pr:fus1pr_fwd和核苷酸序列如seq id no:13所示的gal4pr:fus1pr_rev为引物(表1)，扩增目标为酿酒酵母cen.pk2-1c chromosome iii(genebank:bk006937)中的fus1基因启动子区域，经pcr扩增得到gal4pr:fus1pr整合片段，pcr扩增条件为：98℃2min，98℃15s，54℃15s，72℃30s，循环30次；72℃1min。
[0056]
以酿酒酵母cen.pk2-1c基因组为模板，以核苷酸序列如seq id no:14所示的gal4pr:prm2pr_fwd和核苷酸序列如seq id no:15所示的gal4pr:prm2pr_rev为引物(表1)，扩增目标为酿酒酵母cen.pk2-1c chromosome ix(genebank:bk006942)中的prm2基因启动子区域，经pcr扩增得到gal4pr:prm2pr整合片段，pcr扩增条件为：98℃2min，98℃15s，54℃15s，72℃30s，循环30次；72℃1min。
[0057]
实施例3构建质粒
[0058]
以白色念珠菌atcc90028基因组为模板，以核苷酸序列如seq id no:18所示的ca ste2_f和核苷酸序列如seq id no:19所示的caste2_r为上下游引物(表1)，经pcr扩增得到caste2基因，pcr扩增条件为：98℃2min，98℃15s，50℃15s，72℃1min，循环30次；72℃2min。将caste2基因片段用bamhi和xhoi酶切，使用neb t4 dna连接酶以及其建议的反应方法将片段连接进入经过bamhi和xhoi双酶切的表达载体p416tef2，得到载体p416tef2-caste2。
[0059]
以载体pk0127(addgene#8728)为模板，以核苷酸序列如seq id no:20所示的egfp_f和核苷酸序列如seq id no:21所示的egfp_r为上下游引物(表1)，经pcr扩增得到egfp基因，pcr扩增条件为：98℃2min，98℃15s，54℃15s，72℃30s，循环30次；72℃1min。将egfp基因片段用bamhi和xhoi酶切，使用neb t4 dna连接酶以及其建议的反应方法将片段连接进入经过bamhi和xhoi双酶切的表达载体p425gal1，得到载体p425gal1-egfp。
[0060]
以酿酒酵母cen.pk2-1c基因组为模板，以核苷酸序列如seq id no:22所示的prm2pr_f和核苷酸序列如seq id no:23所示的prm2pr_r为上下游引物(表1)，扩增目标为酿酒酵母cen.pk2-1c chromosome ix(genebank:bk006942)中的prm2基因启动子区域，经pcr扩增得到prm2pr基因，pcr扩增条件为：98℃2min，98℃15s，54℃15s，72℃30s，循环30次；72℃1min。将prm2pr基因片段用bamhi和saci酶切，使用neb t4 dna连接酶以及其建议的反应方法将片段连接进入经过bamhi和saci双酶切的表达载体p425gal1-egfp，得到载体p425prm2pr-egfp。
[0061]
实施例4获取酿酒酵母重组菌株js-ste-1
氟乳清酸筛选去除grna表达载体，经ypd固体培养基传代培养去除cas9表达载体，得到重组菌株js-ste-1c。
[0076]
将实施案例3获取的p416tef2-caste2、p425prm2-egfp电转化转入酿酒酵母js-ste-1c感受态细胞，以ynbd-leu-ura固体培养基中筛选，获取阳性单克隆克隆jsd-ste-1cp。
[0077]
实施例10酿酒酵母重组菌株剂量反应曲线
[0078]
将jsd-ste-p1c菌株接种在ynbd-leu液体培养基培养至od
600
为10后，按1:100比例接入20ml ynbd-leu-ura培养液中培养12h后，离心获得菌体，使用新鲜ynbd-leu-ura重悬菌体使菌体od为2，三份2ml菌液为一组分别添加不同浓度白色念珠菌信息素至终浓度分别为10-3
、10-2
、10-2
、10-1
、100、101、102、103、104nm，同时设置不添加信息素的对照组。每2h测定od
600
和egfp数据，直到培养12h。jsd-ste-1cp作为对照菌株进行同样的实验。选取6h数据使用graphpad prism7进行剂量反应曲线的拟合。
[0079]
结果如图4所示，重组菌株jsd-ste-p1c通过异源表达白色念珠菌信息素受体ste2能够特异性地识别白色念珠菌α因子信息素，并在感知低浓度信息素后产生强烈的绿色荧光蛋白信号。
[0080]
综上，根据本发明实施例的酿酒酵母重组菌株，该酿酒酵母重组菌株敲除了丝氨酸/苏氨酸细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂far1、半乳糖诱导系统的负调节因子gal80、内源gpcr受体ste2，并将半乳糖诱导系统转录激活因子gal4的启动子替换为酵母信息素响应基因prm2的启动子；上述基因编辑后的菌株进一步采用持续性tef2启动子驱动异源表达病原体真菌信息素gpcr受体和半乳糖启动子gal1驱动的绿色荧光蛋白egfp。上述重组菌株通过异源表达白色念珠菌信息素受体ste2能够特异性地识别白色念珠菌α因子信息素，并在感知低浓度信息素后产生强烈的绿色荧光蛋白信号。该检测系统具有低渗漏、较高的信噪比等特点，可作为检测病原体真菌的生物传感器。本发明所述的酿酒酵母生物传感器具有安全性高、便携稳定、成本低等特点，具有较好的病原体真菌检测应用前景。
[0081]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
[0082]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。