一种用于检测小麦籽粒锌含量的分子标记AX-110119937及其应用

本发明属于snp分子标记，具体涉及一种用于检测小麦籽粒锌含量的分子标记ax-110119937及其应用。

背景技术：

1、微量营养元素缺乏，又称“隐性饥饿”，特别是锌的缺乏，对人体造成严重的危害，是全球范围内迫切需要解决的问题。小麦作为世界主要粮食作物之一，在确保粮食安全和营养状况方面扮演着重要角色。然而，由于历史选择问题，现代小麦品种的籽粒锌含量普遍较低，为了满足人体健康的需求，国内外的籽粒锌含量遗传改良工作正在逐步推进。近年来，分子标记的快速发展为小麦籽粒锌含量遗传改良提供了机遇。利用分子标记可以有效地鉴定籽粒锌含量相关遗传位点，并利用分子标记辅助选择策略进行籽粒锌含量的遗传改良，提高选择效率，大大缩短育种年限。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：如何筛选或辅助筛选富锌小麦。

2、为解决上述技术问题，第一个方面本发明提供鉴定或辅助鉴定小麦籽粒锌含量性状的方法，所述方法包括使用检测ax-110119937位点基因型的物质检测待测小麦的基因型，根据待测小麦的基因型鉴定或辅助鉴定待测小麦的籽粒锌含量性状；

3、所述ax-110119937位点是小麦基因组中的一个snp位点，如seq id no.1的第36位核苷酸，其核苷酸种类为g或a，

4、所述ax-110119937位点的基因型为gg的待测小麦的籽粒锌含量高于或候选高于所述ax-110119937位点的基因型为aa的待测小麦；

5、其中，所述基因型为gg表示小麦基因组中所述ax-110119937位点的核苷酸种类为g的纯合型；所述基因型为aa表示小麦基因组中所述ax-110119937位点的核苷酸种类为a的纯合型。

6、进一步地，上述的方法中，所述检测ax-110119937位点基因型的物质为如下a1)、a2)或a3)：

7、a1)所述检测ax-110119937位点基因型的物质为扩增包括所述ax-110119937位点在内的小麦基因组dna片段的pcr引物组合物；

8、a2)所述检测ax-110119937位点基因型的物质为含有所述pcr引物组合物的pcr试剂；

9、a3)含有a1)所述pcr引物组合物或a2)所述pcr试剂的试剂盒。

10、进一步地，上述的方法中，所述pcr引物组合物包括核苷酸序列是seq id no.2的第22-40位的单链dna、核苷酸序列是seq id no.3的第22-40位的单链dna和核苷酸序列是seq id no.3的单链dna。

11、进一步地，上述的方法中，所述pcr引物组合物包括核苷酸序列是seq id no.2所示的引物a、核苷酸序列是seq id no.3所示的引物b和核苷酸序列是seq id no.4所示的引物c。

12、进一步地，上述的方法中，所述pcr引物组合物中，所述引物a、引物b和引物c的物质的量的比值为2:2:5。

13、进一步地，上述的方法中，其特征在于：所述方法包括检测待测小麦的上述ax-110119937位点的基因型，根据所述基因型鉴定或辅助鉴定小麦籽粒锌含量，所述ax-110119937位点的基因型为gg的待测小麦的籽粒锌含量高于或候选高于所述ax-110119937位点的基因型为aa的待测小麦。

14、进一步地，上述的方法中，所述检测待测小麦的所述ax-110119937位点的基因型的方法包括以待鉴定小麦基因组dna为模板，利用上述pcr引物组合物进行kasp，得到pcr产物；根据pcr产物的荧光信号确定所述基因型。

15、上述方法具体包括下述操作步骤：

16、s1)提取待测小麦的基因组dna；

17、s2)以s1)提取的基因组dna为模板，以上述pcr引物组合物为扩增引物，进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；

18、s3)根据pcr扩增产物的ax-110119937位点的基因型判断或辅助判断待测小麦籽粒的锌含量性状；

19、所述ax-110119937位点的基因型为gg的待测小麦的籽粒锌含量高于或候选高于所述ax-110119937位点的基因型为aa的待测小麦。

20、进一步地，上述的方法中，s2)所述的引物组合物包括引物a、所述引物b和所述引物c。

21、进一步地，上述的方法中，s3)步骤中根据所述pcr产物的荧光显色判断ax-110119937snp位点的基因型。

22、进一步地，所述引物a和所述引物b的5'端为特异性荧光标签序列。

23、进一步地，所述引物a和所述引物b的5'端的特异性荧光标签序列不同，结合不同发光类型的荧光探针。

24、在本发明的一个实施例中，引物a第1-21位核苷酸为特异荧光标签序列fam，引物b第1-21位核苷酸为特异荧光标签序列hex。

25、更具体地，上述引物a与引物c扩增产物的ax-110119937 snp位点基因型为gg，携带fam荧光接头序列，pcr扩增后的产物经荧光照射显示蓝色；

26、上述引物b与引物c扩增产物的ax-110119937 snp位点基因型为aa，携带hex荧光接头序列，pcr扩增后的产物经荧光照射显示红色；

27、上述引物a、引物b与引物c扩增产物的ax-110119937 snp位点基因型为ga；pcr扩增后的产物经荧光照射显示绿色。即：

28、所述pcr产物经荧光照射显示蓝色，则ax-110119937位点基因型为gg；

29、所述pcr产物经荧光照射显示红色，则ax-110119937 snp位点基因型为gg；

30、所述pcr产物经荧光照射显示绿色，则ax-110119937 snp位点基因型为ga。

31、所述基因型为gg表示小麦基因组中所述ax-110119937位点的核苷酸种类为g的纯合型；所述基因型为aa表示小麦基因组中所述ax-110119937位点的核苷酸种类为a的纯合型；所述基因型为ga表示小麦基因组中所述ax-110119937位点的核苷酸种类为g和a的杂合型。

32、具体地，步骤s2)中，以步骤s1)获得的dna为模板，所述的pcr引物组(引物a、引物b和引物c)进行pcr扩增，得到扩增产物。pcr反应体系如下：2.0μl烘干的dna，0.056μl kasp引物工作液，2.5μl 2×kasp master mix(lgc genomics，https://www.lgcgroup.com/)，2.5μl无菌水。kasp引物工作液的两条竞争性引物(引物a和引物b)的浓度分别为12μm，通用引物(引物c)的浓度为30μm。，即引物工作液中引物a、引物b与引物c的物质的量的比值分别为2:2:5。2×kasp master mix中含有针对上游引物标签序列(fam和hex)合成的两个通用荧光探针和两个通用淬灭探针。

33、pcr扩增程序为采用s1000tm thermal cycler 384孔pcr仪进行pcr反应，反应程序包括三个阶段：(1)95℃变性15min；(2)95℃变性20s，65-55℃退火/延伸1min，10个降落循环，每个循环降低1℃；(3)95℃变性20s，57℃退火/延伸1min，32个循环。

34、步骤s3)中结果读取：pcr反应结束后利用pherastar plus自动聚焦荧光多功能酶标仪(bmg labtech)读取荧光值，然后将数据导入klustercaller v3.4软件(lgc,hoddesdon,uk)进行基因分型。

35、为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供含有ax-110119937位点的dna分子或检测ax-110119937位点基因型的物质，所述含有ax-110119937位点的dna分子的核苷酸序列是seq id no.1的第36位核苷酸，其核苷酸种类为g或a；所述检测ax-110119937位点基因型的物质为上述的pcr引物组合物。

36、为解决上述技术问题，第三个方面，本发明还提供含有上述pcr引物组合物的试剂盒。

37、为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供ax-110119937位点或检测ax-110119937位点基因型的物质在下述任一种中的应用：

38、c1)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒锌含量性状；

39、c2)筛选或辅助筛选小麦籽粒锌含量高的小麦单株或株系或品系或品种；

40、c3)小麦辅助育种。

41、为解决上述技术问题，第五个方面，本发明提供小麦育种的方法，所述方法包括使用上述ax-110119937位点的基因型为gg的小麦作为亲本进行育种，所述gg基因型表示小麦基因组中所述ax-110119937位点的核苷酸种类为g的纯合型。

42、本发明中，上述育种的目的包括培育或选育籽粒锌含量高的小麦。

43、本发明中，所述小麦籽粒锌含量为小麦植株成熟后的籽粒锌含量。所述ax-110119937位点为位于小麦6d染色体长臂上的序列1所示核苷酸序列的第36位。

44、本发明利用中麦175/小偃60群体在6dl染色体定位到来自小偃60的籽粒锌含量qtl qgznzx.caas-6dl，其对应中国春参考基因组(iwgsc refseq v1.1)的物理区间为458.8–473.0mb。在此研究基础上，本发明将其区间snp标记ax-110119937转化为高通量、低成本和低失误率的kasp标记k_ax-110119937。通过实验证明，本发明所述kasp分子标记k_ax-110119937可用于检测籽粒锌含量qtl qgznzx.caas-6dl的基因型，并用于富锌小麦的分子标记辅助选择育种。