一种研究体外反搏疗法调控动脉内皮细胞功能的体外细胞培养系统及方法

本发明属于细胞力生物学实验装置，具体涉及一种研究体外反搏疗法调控动脉内皮细胞功能的体外细胞培养系统及方法，是基于血流动力学原理、机器学习算法、微流控芯片及智能反馈控制技术，设计的用于同时加载压力、剪切力及周向应力的体外细胞培养微流控芯片、模拟不同反搏模式的体外反搏疗法作用下动脉内皮微环境中的血流动力学信号刺激加载的芯片、多元件循环回路与外围流动加载系统。

背景技术：

1、增强型体外反搏(enhanced external counterpulsation,eecp)是国际上唯一获得美国fda认证、列入美国aha/acc、欧洲esc和中华医学会临床指南推荐的无创性机械辅助循环方法。因其效果显著、操作简便、无创安全等优势，因此在缺血性脑卒中、冠心病、心绞痛以及其他慢性缺血性疾病的治疗中得到广泛应用，并在动脉粥样硬化性心血管疾病的防治与术后康复领域扩大推广。

2、近20多年基础和临床研究认为，eecp的作用机制是通过即时血流动力学效应引发的血管力学生物学效应，即不同体外反搏模式作用下引起的动脉血流动力学微环境改变调控动脉内皮细胞功能以达到预期治疗与康复目的。血管内皮层是介于血液和血管壁之间的一道屏障，能感受到eecp引起的壁面剪切力、血压以及周向应变等血流动力学信号变化，并将血流动力学信号通过一系列的信号通路级联反应传递到细胞内部引起基因和蛋白表达的变化，进一步诱发舒血管因子一氧化氮(no)与缩血管因子内皮素-1(et-1)释放、氧化应激、内皮生长因子分泌等一系列血管内皮功能改变，即内皮细胞力学生物学效应，最终调节包括血管平滑肌在内的血管壁结构和功能重建。因此，eecp改善动脉局部血流动力学微环境促进受损内皮结构和功能的修复已逐步发展为探究eecp有效抑制和延缓心脑血管疾病发生与进展的重要新方向。

3、动物模型与临床实验是探索eecp治疗缺血性脑血管疾病及其作用机制最直接的研究方式。针对eecp血管力生物学效应的在体研究主要集中于定性地探究反搏条件对患者在不同生理和病理条件下内皮细胞功能和宏观病理指标的影响。由于动物和人体的机体复杂性，在体动脉内皮细胞所处的血流动力学微环境非常复杂且易受呼吸、神经调节等其他因素的干扰。此外，动物和人体临床实验中在体血流动力学参数监测受限于监测部位与监测参数，且存在实验周期长、风险大、成本高和伦理学争议等问题。因此，通过在体动物与人体实验定量研究血流动力学信号调控动脉内皮功能及其细胞分子生物学机制依然存在技术瓶颈与现实挑战。

4、与动物实验和临床实验研究相比，体外内皮细胞培养模型(endothelialcellculture model，eccm)研究能很大程度上排除干扰因素提供与体内近似的血流动力学微环境、实现血流动力学参数可控的观测、便于结合传感与成像技术对内皮细胞生物学效应进行监测。通过eccm实验研究血流动力学因素对内皮功能的影响及相关的力学生物学机制，已发展为进入动物模型和临床实验之前的关键研究环节。然而，通过建立eccm研究eecp引起的血流动力学微环境调控动脉内皮细胞功能的应用基础研究尚未见报道。因此，迫切需要设计和构建能够精准模拟在体动脉内皮血流动力学微环境的微型体外模拟循环系统，既能实现不同体外反搏模式下血流动力学信号的精准加载，又能对微流控芯片细胞培养腔内的动脉内皮细胞力学生物学效应进行在线、实时的定量监测，便于更好地分析不同体外反搏模式引起的动脉血流动力学微环境改变调控内皮功能的规律及力学生物学机制，对科学合理地选择反搏条件、优化反搏策略进而促进心脑血管疾病的治疗与康复具有重要的科学意义和临床应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于设计和构建一种能够准确模拟增强型体外反搏不同体外反搏模式引起的动脉内皮血流动力学微环境中血压、壁面剪应力和周向应变(应力)信号并能够在线、实时监测动脉内皮细胞力学生物学效应的体外细胞培养微流控系统及方法。结合血流动力学原理、机器学习算法、微流控芯片技术及智能反馈控制技术，设计的用于同时加载压力、剪切力及周向应变的体外细胞培养微流控芯片，利用神经网络+pde-find算法筛选出表征颈总动脉及其后负荷血流动力学特性的多元件集中参数模型，以该模型为指导搭建多元件体外循环回路与外围流动加载系统，构建内皮细胞功能外围检测与反馈控制系统，以便于模拟患者在不同体外反搏模式下在体动脉内皮细胞所承受的压力、剪应力以及周向应变的组合作用，用于研究不同反搏模式引起的动脉内皮细胞微环境中血流动力学信号差异调控动脉内皮功能的规律及其机制。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种研究体外反搏疗法调控动脉内皮细胞功能的体外细胞培养系统(如图1所示)，包括三个基本单元：第一个基本单元为体外细胞培养微流控芯片及芯片外后负荷血流动力学多元件体外循环回路(如图2所示)。体外细胞培养微流控芯片含有用于动脉内皮细胞培养的细胞培养腔，通过与细胞培养腔连通的芯片外循环回路能够为细胞培养腔内培养的动脉内皮细胞施加压力、剪应力及周向应变信号的组合刺激。体外细胞培养微流控芯片外多元件体外循环回路分为上肢血液循环回路和下肢血液循环回路。其中上肢血液循环回路是以神经网络+pde-find算法筛选出的多元件集中参数模型为指导组成的流体循环回路，包括与体外细胞培养微流控芯片依次连接的弹性腔cu1、流感lu、阻力阀ru1、弹性腔cu2和阻力阀ru2。下肢血液循环回路包括与体外细胞培养微流控芯片依次连接弹性腔cl1、流感ll、阻力阀rl1、弹性腔cl2和阻力阀rl2。

4、第二个基本单元为芯片外围流动加载装置(如图2所示)，具体包括模拟心血管系统动力源的脉动式流体加载装置及模拟体外反搏的脉动式压力加载装置，均可以采用可编程压力控制器(图3中q(t)与p(t))实现。脉动式流体加载装置作为心血管系统动力源，用于模拟患者在体外反搏疗法前的血压波形，通过单向阀分别与上肢血液循环回路和下肢血液循环回路连接；储液池回收上肢血液循环回路和下肢血液循环回路的流体，用于模拟心脏的贮血功能；体外反搏的脉动式压力加载装置接入到下肢血液循环回路的弹性腔cl2(图3中pe)，用于模拟不同体外反搏模式下反搏气囊对小腿、大腿和臀部的序贯加压作用。

5、第三个基本单元为外围检测与反馈控制系统，如图1所示，包括倒置的荧光显微镜、ccd高速摄像系统、压力传感器pi和po、流量传感器q、以及比例-积分-微分反馈控制系统，压力传感器pi和po分别设置在体外细胞培养微流控芯片的入口和出口两端，流量传感器q体外细胞培养微流控芯片的出口处，用于实时监测和采集细胞培养腔输入端和输出端的压力和流量波形，荧光显微镜位于体外细胞培养微流控芯片的上方，ccd高速摄像系统与荧光显微镜相连，用于采集微流控芯片细胞培养腔内细胞的实际形态结构，ccd高速摄像系统、压力传感器、流量传感器、可编程压力控制器均与工控机相连，工控机中包括比例-积分-微分反馈控制模块，比例-积分-微分反馈控制模块用于控制ccd高速摄像系统、压力传感器、流量传感器对细胞培养腔两端的压力和流量波形以及细胞形态结构数据的采集及反馈，比例-积分-微分反馈控制模块可定量调控相关血流动力学信号的变化；通过工控机设置压力波形，可编程压力控制器按照压力波形输出压力，然后压缩储液池的储液管中空气，把培养液挤出来。

6、上述的体外细胞培养微流控芯片(如图4所示)采用三层“三明治”结构，芯片上层、下层分别是含有扁平空气腔与细胞培养腔的透光的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，pdms)单层，上下层之间由弹性薄膜隔开，该弹性薄膜具有与颈总动脉相同的弹性模量。上层空气腔与大气相通，下层细胞培养腔与芯片的入口和出口相连构成流体循环通路。实验中，内皮细胞培养在细胞培养腔上表面(对应弹性薄膜下表面)，当在流体循环通路中加载体外反搏引起的脉动流时，弹性薄膜在压力载荷作用下变形进而产生周向应变，培养的内皮细胞同时受压力、剪切力以及周向应变的组合作用。细胞培养腔几何尺寸、弹性薄膜的弹性模量的选择需根据流体力学与弹性力学原理，以精准模拟颈总动脉处不同反搏模式对应的血压、剪切力和周向应变为标准根据实际确定。

7、所述的体外细胞培养微流控芯片外后负荷血流动力学多元件体外循环回路是通过神经网络+pde-find算法确定的电路模型为指导，其中：动脉内皮细胞的细胞培养腔的流阻等效为电阻(图3中rc)、芯片出口连接的弹性腔的顺应性等效为电容(图3中cu1)、上肢血液循环回路中血管床的顺应性、流阻和流感等效为电容、电阻和电感(图3中cu2、ru1、ru2和lu)、下肢血液循环回路中主动脉壁弹性等效为电容(图3中cl1)、下肢近端动脉的流感、流阻等效为电感和电阻(图3中ll和rl1)、下肢远端动脉的顺应性和流阻等效为电容和电阻(图3中cl2和rl2)。

8、进一步的，芯片外后负荷血流动力学多元件体外循环回路的设计需使细胞培养腔薄膜上培养的内皮细胞承受的压力、壁面剪应力、周向应变与体外反搏疗法期间患者颈总动脉内皮细胞承受的血压、剪应力、周向应变波形一致：

9、首先，以人体或动物实验检测分析得到的在体动脉内皮细胞局部附近的血压p(t)、壁面剪应力τω(t)和周向应变ε(t)波形为模拟目标，为使细胞培养腔弹性薄膜上培养的内皮细胞承受的血压和剪应力波形与在体动脉内皮微环境中的血压和壁面剪应力相等，血流量q(t)和压力降δp(t)需要满足：

10、

11、

12、式中，η为细胞培养液粘度，hc、wc和lc分别为细胞培养腔的高度、宽度和的长度。

13、其次，通过在体动脉的血压p(t)，主动脉根部的血流量q(t)和颈动脉血流量q(t)数据，利用神经网络+pde-find算法，结合实际的生理意义，分别筛选出上肢和下肢血液循环系统最优的集中参数模型，根据流体力学回路与电路之间的相似关系，进而等效颈动脉后负荷血流动力学行为。首先，使用神经网络工具对在体数据进行去噪处理，并利用神经网络自动微分构造候选方程项数据库。接下来通过稀疏回归方法，也就是pde-find算法从候选方程项数据库挑选支配系统运行的非线性项和导数项，从而确定可以准确拟合在体数据的微分方程，分析方程的物理含义，进而构造最优的集中参数模型(如图3所示)。同时按照流体力学与电学的等效规律，将颈动脉后负荷血流动力学行为等效为电路系统。其中流体力学回路上肢循环系统的输入阻抗表示为输入压力波形p(t)和颈动脉血流量波形q(t)在频域上比值，用角频率ωn对应的血压和血流量谐波分量的幅值和相位表征：

14、

15、∠z(ωn)＝∠p(ωn)-∠q(ωn)         (2b)

16、式中，|p(ωn)|和|q(ωn)|分别为血压和血流量经傅里叶变换后，在角频率ωn处的幅值；∠p(ωn)和∠q(ωn)分别为血压和血流量经傅里叶变换后，在角频率ωn处的相角；|z(ωn)|和∠z(ωn)分别为颈动脉下游后负荷输入阻抗在ωn处的幅值和相角。等效上肢系统的电路模型的输入阻抗表示为图3中左侧电路上肢血液循环回路中各电路元件组合而成的复函数，可基于上述流体力学回路中上肢系统输入阻抗的幅频曲线和相频曲线，通过式3中系统辨识方法来确定上肢系统等效集中参数电路模型各元器件的参数值，

17、

18、式中，和分别为集中参数电路模型上肢系统等效输入阻抗在ωn处等效阻抗的幅值和相角。

19、同时，按照同样的方法确定下肢系统等效集中参数电路模型及各元器件的参数值。

20、最后，根据流感(lu和ll)、阻力阀(ru1、ru2、rl1和rl2)、弹性腔(cu1、cu2、cl1和cl2)数值搭建模拟颈动脉后负荷血流动力学特性的多元件体外液体模拟循环系统。

21、如图1和图2所示，系统中的循环液体为体外血管内皮细胞培养液，弹性腔模拟动脉顺应性(流容)，阻力阀模拟粘性阻力(流阻)，流感元件模拟流动惯性。可编程压力控制器通过下肢血液循环系统和脉动式血液泵产生期望的血流量波形。一旦知道细胞培养腔的输入血流量波形，则根据前述等效回路可唯一确定压力波形。

22、上述模拟体外反搏动力源的装置是由脉动式压力加载装置实现的，模拟心血管系统动力源的装置是由脉动式流体加载装置实现的。可使用脉动式流体加载装置和脉动式压力加载装置结合pid反馈控制装置实现缺血性脑卒中患者在体外反搏前后对在体动脉内皮细胞血流动力学微环境中的血压、壁面剪应力和周向应变信号的模拟，将脉动式压力加载装置与下肢弹性腔(cl1和cl2)、阻力阀(rl1和rl2)、流感ll、流体加载装置串联，再和上肢弹性腔(cu1和cu2)、体外细胞培养微流控芯片、阻力阀(ru1和ru2)、流感lu并联接入到上述流体力学循环回路之中，并结合pid反馈控制装置可产生不同体外反搏模式下颈动脉血管内皮细胞承受的血流动力学信号波形，将采集的信号反馈到pid控制装置，可进一步调节流体加载装置及压力加载装置，从而定量调控作用于多元件模拟循环系统的压力、流量信号幅度和频率的变化，最终在微流控芯片细胞培养腔产生基于不同体外反搏模式下的血压、剪应力和周向应变的组合作用。

23、一种研究体外反搏疗法调控动脉内皮细胞功能的方法，具体是应用上述系统研究不同体外反搏模式与颈动脉内皮微环境血流动力学信号之间定量关系的，步骤如下：

24、步骤一：将原代培养的内皮细胞进行传代培养，第2-5代用于实验。调整体外细胞培养微流控系统中流感(lu和ll)、阻力阀(ru1、ru2、rl1和rl2)、弹性腔(cu1、cu2、cl1和cl2)数值的大小，往细胞培养腔中通入循环液体，通过调控可编程压力控制器，在不同体外反搏模式下，加载对于颈动脉内皮细胞各种血流动力学信号的组合刺激。

25、步骤二：继续加载上述工作模式对应的血流动力学信号刺激，之后对细胞进行活性检测，以确保上述系统的有效性。

26、步骤三：从体外细胞培养微流控芯片细胞培养腔内收集细胞样本，并进行基因和蛋白表达水平的检测，以此分析不同体外反搏模式引起的血压、剪应力、以及周向应变等血流动力学信号对血管活性物质及促炎性细胞因子基因和蛋白表达水平的影响。

27、本发明的有益效果：本发明基于上述体外细胞培养微流控系统能够准确模拟患者不同体外反搏模式引起的动脉内皮微环境中血压、壁面剪应力和周向应变等血流动力学信号，并使用集成度更高、耗材更少、便于结合光学检测和传感的体外细胞培养微流控芯片研究上述模式下血流动力学信号的组合刺激对动脉内皮细胞功能的差异化影响，为定量分析血流动力学信号对动脉内皮细胞功能的影响规律及分子生物学机制提供了高效合理的实验平台，且为筛选出有益于改善或维持动脉内皮功能的血流动力学条件，为科学合理地选择反搏条件、优化反搏策略提供依据。