培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其涉及培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用。

背景技术：

1、手术，放疗和化疗是癌症治疗的三大基石，可迅速清除大量的肿瘤细胞，降低体内肿瘤细胞负荷，但实际上任何一种单一疗法都无法彻底清除体内癌细胞。长期放射治疗会导致患者出现恶心、呕吐等不良反应。分子靶向药物治疗，在使用及疗效上也具有一定的局限性。

2、近年来，生物免疫治疗在肝癌治疗领域体现出一定的疗效。随着免疫学与分子生物学的发展，过继性免疫细胞治疗逐渐成为恶性肿瘤免疫治疗研究的趋势。过继细胞免疫治疗作为一种新型治疗手段，受到越来越多的关注，尤其对于晚期转移病人或重症病人，是延长生存时间、提高生存质量的重要手段。

3、过继性免疫细胞治疗(adoptive cell transfer therapy,act)是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，增加防御细胞的兵力，或者是对免疫细胞进行改造，使其成为靶向性杀伤功能增强的超级警察细胞，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力。免疫细胞治疗技术具有疗效好、不良反应少或无、无耐药性等显著优势，近年来发展迅速，被誉为继外科手术、药物治疗、放射治疗后最有前景的肿瘤治疗技术之一。免疫细胞包括人体的t细胞、nk细胞、b细胞、dc(树突状细胞)细胞等，是人体的防卫军。

4、目前，为了使过继免疫细胞具有更好的临床获益，得到具有更好的持久性杀伤肿瘤能力的t细胞，研究者们做了多种尝试。其中主要可以分为以下几类：1、改变t细胞外共刺激结构域的类型，降低免疫原性而增加细胞存活持久性；2、通过在培养基中添加细胞因子、抗氧化剂等，抑制效应器分化或免疫抑制细胞产生，促进tscm及记忆细胞亚群的扩增比例，提高细胞的持久性；3、输注t细胞产品前，对患者进行淋巴清除，减少或清除调节性t细胞和其他免疫抑制细胞，增加细胞的扩增能力和持久性。过继性免疫细胞治疗主要包括til、lak、cd3ak、cik、dc、nk、tcr-t、car-t等几大类。

5、体外应用白细胞介素2(il-2)活化、扩增可获得自体或同种具有抗瘤活性的效应细胞被称为lak细胞。将lak细胞回输给肿瘤患者能产生一定的杀伤活性，杀伤瘤谱较广泛，且不损伤正常的淋巴细胞。最早使用的lak细胞疗法虽然在肾癌患者体内产生一定疗效，但由于其体外扩增和体内维持需要大剂量il-2，会造成大量的副作用，而且对于许多病患的反应性有限。

6、cd3ak疗法是在lak的基础上建立的细胞疗法。它使用肿瘤患者的外周淋巴细胞，体外在抗cd3单抗与il-2的共同刺激下活化增殖，产生以 cd3+cd8+t细胞为主的杀伤细胞群，回输到患者体内治疗肿瘤得到了一些良好的效果。研究报道cd3ak疗法能延长肝癌患者生存率，两年生存率约为 33％。cd3ak疗法可以获得比lak细胞治疗多的效应细胞，而且不需大量 il-2的维持，副作用也相对出现少，这种方法也被临床应用。

7、cik细胞是由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，相比cd3ak又增加了更多的细胞因子。它是人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子如il-2、ifn-γ和cd3单克隆抗体等诱导而成的具有杀伤多种肿瘤活性的细胞毒性t细胞。 cik细胞的增殖速度较lak和cd3ak细胞有了更大地提高，具备更强的杀瘤活性，而且其体内杀伤活性的维持不必依赖大剂量外源性il-2的持续给予。 cik疗法在临床治疗实体肿瘤也取得了一定的效果。但目前国内应用的cik 细胞培养方法，在培养2周时，细胞的体外扩增倍数大多不超过100倍，未能获得能够进一步提高临床治疗有效率的细胞数量。

8、til细胞是一种淋巴细胞称为肿瘤浸润淋巴细胞(til)，它是一种新型的抗肿瘤效应细胞。由于肿瘤微环境的复杂，til并不能发挥较好的杀伤肿瘤效果。所以通过拿出癌组织，切碎将癌组织中的t细胞拿到体外进行扩增，回输到体内。此类细胞虽能发挥一定的杀伤肿瘤的效果，但是由于细胞来源于肿瘤组织，此类t细胞培养数量受到大大限制，而且回输后有增加癌症负荷的风险。

9、tcr-t(t-cell-receptor t cell)以及car-t(chimeric antigen receptor tcell)细胞通过增加t细胞的识别能力，增强了t细胞的靶向性，然而由于都采用了基因编辑的手段处理细胞，使得细胞更容易耗竭，并且通常存在 on-target/off-tumor的效应，容易引起强烈的细胞因子风暴等，增加了副作用的产生。另外，基因编辑脱靶效应所导致的其他副反应仍不清晰。

10、目前，对于过继性免疫细胞治疗领域，从安全性上表明，cik细胞的安全性明显较其他细胞类型更好，且具有较为广泛的杀伤瘤谱。然而，目前cik 细胞培养方案中，细胞毒性t细胞的增殖能力有限，肿瘤杀伤能力相对较弱。马洁教授通过在cd3ak细胞中加入retronectin，研制出一款rak细胞，大大提高了细胞毒性t细胞的增殖能力，使原本只能扩增100倍的cd3ak达到扩增500倍左右的程度，然而，在rak细胞产品中，il-2作为诱导激活t淋巴细胞增殖的主要细胞因子，除具有促进细胞毒性t淋巴细胞增殖及刺激细胞二次增长的作用外，同时也会诱导treg细胞的增殖分化。然而，大量研究报道treg细胞具有免疫抑制作用，在一定程度上会抑制免疫细胞的肿瘤杀伤能力。与其他的免疫细胞治疗技术相似，rak细胞耗竭快，持续作用时间短、肿瘤杀伤能力有限，此问题依然是过继性免疫细胞治疗的关键瓶颈，有待进一步突破。

11、研究认为，在慢性抗原刺激下，t细胞干性和耗竭同时共存于细胞发展过程中。干性t细胞具有自我更新、多能性和功能持久性；而t细胞耗竭则会导致细胞效应器功能丧失，在细胞增殖和细胞因子产生方面表现出严重缺陷。而在免疫细胞中，原始t细胞和一些记忆t细胞亚群具有干细胞特性，许多研究均支持记忆t细胞分化的渐进模型为原始t细胞-记忆干细胞-中央记忆细胞-效应记忆细胞；细胞干性越强，则细胞耗竭越慢。另外，越来越多的研究显示，在免疫t细胞中，虽然表达cd8分子的毒性t淋巴细胞虽然发挥着主要的溶解靶细胞的作用，但是辅助性t细胞同样具有非常重要的辅助杀伤的能力。cd4+t细胞是效应t细胞的重要成分，根据所产生的细胞因子和效应细胞的生物功能特征，又可将其分为th1、th2、treg、th17、th22和tfh等。研究表明，th1细胞可分泌ifn-γ和il-2，进一步活化cd8+t细胞，促进细胞免疫；而th2、treg细胞等反而容易引起免疫抑制，促进肿瘤的发生发展。幸运的是，我们前期研究显示在我们所培养的免疫细胞中，在cd4+t细胞中 th1细胞占多数，而其他如th2、treg等细胞比例较小。

12、综上，我们需要一种新的刺激免疫t细胞增殖的配方，在保证机体安全性的情况下，达到更好的杀伤实体肿瘤的作用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用。本发明通过添加诱导因子，改变激活细胞方式，研究发明了一种新型的细胞培养的方法，制备了新型刺激细胞增殖的配方，增加诱导辅助性cd4+t细胞的分化，获得混合型t细胞，增强inf-γ分泌能力，延缓免疫细胞耗竭，保持细胞增殖速率，提高肿瘤细胞杀伤能力，以培养出具有更好的杀伤实体肿瘤作用的混合型免疫t细胞。该细胞培养方法由可以延伸至其他的相同类型的细胞中刺激培养，可以达到更好的降低耗竭细胞的比例，并发挥更好的杀伤肿瘤的作用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了组分1和/或组分2在培养免疫细胞中的应用；

4、所述组分1包括il-21；

5、所述组分2包括cd3和重组人纤维连接蛋白。

6、在本发明的一些实施方案中，上述应用，包括但不限于以下任意一项：

7、(i)、增加诱导辅助性cd4+t细胞的分化；和/或

8、(ii)、增强inf-γ分泌能力；和/或

9、(iii)、延缓免疫细胞耗竭；和/或

10、(iv)、保持免疫细胞增殖速率；和/或

11、(v)、制备提高肿瘤细胞杀伤能力的制剂或药物。

12、本发明还提供了培养组合物，上述培养组合物包括培养基和包被液；所述培养基包括基础培养基和il-21；所述包被液包括cd3和重组人纤维连接蛋白。

13、在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物中所述il-21的浓度为 10～50ng/ml。

14、在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物中所述il-21的浓度为 50ng/ml、30ng/ml或10ng/ml。

15、在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物中所述基础培养基包括 gt-t551-h3培养基。

16、在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物还包括il-2或血浆。

17、在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物中所述il-2的浓度为1000 单位/ml。

18、在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物中所述cd3的浓度为 5μg/ml。

19、在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物中所述重组人纤维连接蛋白的浓度为10μg/ml。

20、本发明还提供了上述培养组合物在培养免疫细胞中的应用。

21、本发明还提供了免疫细胞的制备方法，取免疫细胞与上述培养组合物中的所述培养基混合，接种至经上述培养组合物中的包被液包被的培养载体，培养，获得所述免疫细胞。

22、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述免疫细胞为t淋巴细胞或rak细胞。

23、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述混合后，所述接种前，还包括与血浆混合的步骤。

24、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述血浆的制备方法包括以下步骤：取外周血离心，收集上清，灭活后，获得所述血浆。

25、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述免疫细胞的制备方法包括以下步骤：

26、s1：取外周血离心后，取下层细胞稀释后，获得稀释液；

27、s2：取所述稀释液与细胞分离液混合，离心，去上清后，取中间白膜层，获得所述免疫细胞。

28、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法s1中所述离心的转速为 2200rpm，时间为20min。

29、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法s1中所述稀释采用氯化钠溶液，所述氯化钠溶液与下层细胞的体积比为1:1。

30、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法s2中所述稀释液与所述细胞分离液的体积比为1:1。

31、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法s2中所述离心的转速为 2000rpm，时间为20min，温度为15～25℃。

32、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法s2中所述离心的升速为1，降速为0。

33、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法s2中所述取中间白膜层还包括清洗的步骤，所述清洗采用生理盐水。

34、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述清洗的转速为 1400～1500rpm，时间为8min，温度为15～25℃，次数不少于3次。

35、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述接种的密度为1×106个/ml。

36、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述培养的时间为 24～360h，温度为37℃。

37、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述培养包括第一培养～第八培养。

38、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第一培养的时间为自第24h至第72h，温度为37℃。

39、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第二培养的时间为自第72h至第120h，温度为37℃。

40、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第三培养的时间为自第120h至第168h，温度为37℃。

41、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第四培养的时间为自第168h至第216h，温度为37℃。

42、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第五培养的时间为自第216h至第264h，温度为37℃。

43、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第六培养的时间为自第264h至第288h，温度为37℃。

44、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第七培养的时间为自第288h至第336h，温度为37℃。

45、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第八培养的时间为自第336h至第360h，温度为37℃。

46、具体的，本发明提供的免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：

47、s1：取外周血离心后，收集上层灭活，获得灭活后的自体血浆；收集下层稀释，获得血细胞；

48、s2：取所述血细胞与淋巴细胞分离液混合，2000rpm，15～25℃离心， 1400～1500rpm，15～25℃清洗后，获得淋巴细胞；

49、s3：取所述淋巴细胞接种于上述包被液包被的培养载体中，培养，获得所述免疫细胞；

50、s3中所述培养采用包括10～50ng/ml的il-21和基础培养基，时间为 24～360h。

51、本发明还提供了药物或制剂，包括上述制备方法获得的免疫细胞。

52、本发明提供了组分1和/或组分2在培养免疫细胞中的应用；

53、所述组分1包括il-21；

54、所述组分2包括cd3和重组人纤维连接蛋白。

55、本发明的有益效果包括：

56、(1)本发明通过添加诱导因子，改变激活细胞方式，研究发明了一种新型的细胞培养的方法，制备了新型刺激细胞增殖的配方，增加诱导辅助性 cd4+t细胞的分化，获得混合型t细胞，增强inf-γ分泌能力，延缓免疫细胞耗竭，保持细胞增殖速率，提高肿瘤细胞杀伤能力，以培养出具有更好的杀伤实体肿瘤作用的混合型免疫t细胞。该细胞培养方法由可以延伸至其他的相同类型的细胞中刺激培养，可以达到更好的降低耗竭细胞的比例，并发挥更好的杀伤肿瘤的作用。

57、(2)本发明保留cd3+cd8+t细胞的高倍扩增能力。本发明通过保留使用retronectin以及cd3单抗作为包被激活液的一部分，使免疫细胞在初期得到充分的激活。retronectin是重组人纤维连接蛋白片段，包括细胞结合域，肝磷脂结合域和cs1位点三个功能区域，由574个氨基酸组成，分子量63kda。 retronectin特异性单克隆抗体为捕捉抗体，并且将其包被于微孔板，方便刺激淋巴细胞，使其获得激活增殖。cd3为在t细胞上发现的一次跨膜蛋白，有四种亚型即cd3d,cd3e,cd3g和cd3z,其cd3d/cd3e,cd3g/cd3e为异源二聚的形式和tcr的α链和β链形成tcr-cd3复合物。抗原呈递细胞 (apc)呈递的特异性mhc多肽复合物能够和tcr-cd3复合物，诱导t细胞的激活。cd3抗体与细胞膜上cd3抗原结合后，会刺激淋巴细胞激活。

58、(3)本发明通过添加il-2和il-21保持了细胞活率，或使细胞活率增高，增强肿瘤杀伤能力。il-2、il-21均是γ-chain细胞因子家族主要成员，共同享用同一个γ-chain受体，因此在激活下游通路时具有许多相似或重叠功能。不同于il-2主要促进效应细胞快速增殖和蛋白合成，il-21的不同在于跟受体复合物与stat3的亲和力；使它在调节记忆t细胞的维持和发展方面更好。在对treg细胞的影响方面，il-2对treg细胞具有较强的刺激增殖的作用，远远高于il-21。通过在培养基中加入一定剂量的il-21，使il-21与il-2竞争γ-chain 受体，在共同刺激细胞增殖的情况下，诱导cd4+t细胞更多的分化而减少 treg细胞的产生，促进细胞分泌inf-γ，增强细胞杀伤能力。与此同时，降低了细胞耗竭的比例。

59、(4)如原理图(图1)中所示，本发明通过同时扩增cd4+t细胞与cd8+ t细胞，即维持了cd8+t细胞的杀伤功能，同时通过cd4+t细胞分泌inf-γ因子，一方面二次刺激cd8+t细胞的增殖，cd8+t细胞通过抗原抗体识别作用，发挥溶细胞作用，达到更持久杀伤靶细胞的效果。另一方面通过与肿瘤细胞中的受体结合直接诱导靶细胞凋亡。肿瘤杀伤能力得到进一步提升。

60、(5)现有技术与本发明技术对比如下表所示；

61、 cik rak 本发明 扩增倍数100倍 扩增倍数500倍 扩增倍数500倍 30:1效靶比杀伤率低 30:1效靶比杀伤率低 30:1效靶比杀伤率高 inf-γ分泌量低 inf-γ分泌量中 inf-γ分泌量高 辅助性cd3+cd4+t细胞少 辅助性cd3+cd4+t细胞少 辅助性cd3+cd4+t细胞高