预测肺腺癌免疫治疗不良反应的lncRNA标记物及预测试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测，具体涉及预测肺腺癌免疫治疗不良反应的lncrna标记物以及预测试剂盒。

背景技术：

1、肿瘤治疗领域的不断拓展和创新，开辟了一系列的具有良好治疗效果的药物，如基于免疫检查点抑制剂(pd1/pd-l1)开发出来的各种药物，如k药(keytruda)、o药(opdivo)和i药(imfinzi)等，给许多癌症患者带来了良好的治疗效果，延缓了疾病进展和延长了患者的生命时间。然而在治疗过程中，患者使用药物以后，有一部分患者由于机体对药物的反应，引起了一些免疫不良反应(immune-related adverse events，iraes)，甚至严重的免疫不良反应会危及生命。

2、免疫相关不良反应是指由调节t细胞活性所导致的免疫激活，可引起免疫相关的不良反应，从而引起相应器官的相关症状。症状有轻有重，轻的症状如恶心、呕吐、咳嗽等。严重的症状如胸痛、免疫相关肠炎、免疫相关肺炎、脑炎等，病情严重的肺炎、脑炎等可能会危及患者生命。所以肿瘤患者在使用免疫治疗药物以后，能够及时的预测或是检测有可能发生的免疫不良反应，对肿瘤患者有非常重大的临床意义。在寻找肿瘤标记物的同时，也要考虑检测是否便捷和无创，尽量减少对患者的二次伤害。所以如何采用尽量无创的样本如血液、尿液进行预测标记物的探索也是需要考虑的。

3、最近几年研究比较火热的生物物质外泌体(exosome)，由于其体积小，可以在尿液、血液等体液中自由流动，成为标记物研究的重点研究对象。而且外泌体内存在着非常丰富的内容物，如膜蛋白、膜内蛋白、dna、mrna、lncrna、circrna等。研究结果也显示，外泌体作为细胞与细胞之间通讯的传递物质，参与众多的生物学过程，包括炎症反应、调控因子转移等，其中外泌体内的相关rna与肿瘤也有密切的关系。

4、lncrna是一类不编码蛋白质但具有生物学功能的rna，目前人类基因组中已经发现了数千个lncrna。许多lncrna在循环的体液中保持相对稳定，在某些癌症类型中差异表达的lncrna可以作为癌症的生物标志物。例如外泌体lncrna lnmat2可以促进膀胱癌淋巴转移。外泌体lncrna-gc1存在于胃癌患者血清外泌体中，且在胃癌早期高表达。

5、本发明以外泌体作为研究对象，利用高通量的ngs(next-generation sequencingtechnology)技术对外泌体内lncrna进行测序和分析，探索其中可能的可以预测和早期检测免疫不良反应的生物标记物。

技术实现思路

1、本发明的目的是，提供一种肺腺癌免疫治疗不良反应的lncrna标记物以及预测试剂盒。

2、本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

3、本发明提供的预测肺腺癌免疫治疗不良反应的lncrna标记物为arap1-as2、tmem161b-as1、zbed5-as1、bace1-as、trim52-as1、gusbp11、wdr11-as1基因中的一种或它们的任何组合。

4、作为优选实施方案，所述免疫治疗不良反应为pd-1抑制剂或pd-1抑制剂联合用药治疗引起的免疫相关不良反应。所述pd-1抑制剂为特瑞普利单抗、卡瑞利珠单抗等。pd-1抑制剂联合用药治疗的方式为：pd-1抑制剂联合培美曲赛、白蛋白结合紫杉醇等联合治疗。免疫不良反应包括肺炎、心肌炎、神经炎或脑炎等。

5、本发明还提供一种肺腺癌免疫治疗不良反应的预测试剂盒，该试剂盒包括：检测所述lncrna标记物的表达水平的试剂。

6、作为优选实施方案，检测所述lncrna标记物的引物为以下至少其一的引物对：

7、检测arap1-as2基因的引物对为seq id no:4所示的上游引物和seq id no:5所示的下游引物；

8、检测tmem161b-as1基因的引物对为seq id no:6所示的上游引物和seq id no:7所示的下游引物；

9、检测zbed5-as1基因的引物对为seq id no:8所示的上游引物和seq id no:9所示的下游引物；

10、检测bace1-as基因的引物对为seq id no:10所示的上游引物和seq id no:11所示的下游引物；

11、检测trim52-as1基因的引物对为seq id no:12所示的上游引物和seq id no:13所示的下游引物；

12、检测gusbp11基因的引物对为seq id no:14所示的上游引物和seq id no:15所示的下游引物；

13、检测wdr11-as1基因的引物对为seq id no:16所示的上游引物和seq id no:17所示的下游引物。

14、作为优选实施方案，所述试剂盒还包括检测内参基因的试剂，所述内参基因为gapdh和/或actb。

15、作为优选实施方案，检测所述内参基因的引物为以下至少其一的引物对：

16、检测gapdh基因的引物对为seq id no:18所示的上游引物和seq id no:19所示的下游引物；

17、检测actb基因的引物对为seq id no:20所示的上游引物和seq id no:21所示的下游引物。

18、本发明还提供所述试剂盒预测肺腺癌免疫治疗不良反应的方法，包括如下步骤：

19、步骤1，将待测样本进行血浆外泌体微量rna抽提；

20、步骤2，对抽提的外泌体总rna进行逆转录，逆转录体系采用的基因扩增引物池包括：t7启动子序列、通用序列、标签序列和用于检测arap1-as2、tmem161b-as1、zbed5-as1、bace1-as、trim52-as1、gusbp11、wdr11-as1其中至少一种基因的引物；

21、步骤3，将逆转录产物cdna进行转录反应，得到的转录产物再进行逆转录及第一pcr反应，逆转录和第一pcr反应于同一体系内进行，该逆转录和第一pcr反应采用的基因扩增引物与步骤2相同；

22、步骤4，将第一pcr反应的产物进行纯化，纯化产物采用带有udi的通用引物进行第二pcr反应；由于第一pcr反应中采用的基因扩增引物池包含通用序列，因此第二pcr反应可以直接采用通用序列中的任意部分序列作为通用引物进行扩增。

23、步骤5，将第二pcr反应的产物进行纯化，得到纯化的文库；然后上机进行分析和结果解读。

24、作为优选实施方案，所述步骤2中基因扩增引物池的正向引物为：t7启动子序列+正向通用序列+正向标签序列+靶向基因上游引物，反向引物为：反向通用序列+反向标签序列+靶向基因下游引物；其中，t7启动子序列如seq id no:1所示；正向通用序列如seq idno:2所示，正向标签序列为nnnnn(n)-s-t，(n)-s-表示该碱基为硫代修饰；反向通用序列如seq idno:3所示，反向标签序列为nnnnn(n)-p，(n)-p-表示该碱基为磷酸化修饰。

25、作为优选实施方案，所述步骤2中的逆转录体系为：外泌体rna，逆转录酶150-250u，逆转录缓冲液，dntp 0.1-1mm，基因扩增引物池；所述引物池中每条引物的浓度为0.05-0.5μm，引物池包括：检测arap1-as2、tmem161b-as1、zbed5-as1、bace1-as、trim52-as1、gusbp11、wdr11-as1其中至少一种靶向基因的引物和检测gapdh、actb其中至少一种内参基因的引物。

26、作为优选实施方案，所述步骤3中转录反应体系为：t7 rna聚合酶140u-240u，转录缓冲液，atp 1-3mm，gtp 1-3mm，ctp 1-3mm，utp 1-3mm。

27、作为优选实施方案，所述步骤3中逆转录和第一pcr反应的体系为：m-mlv逆转录酶、热稳定无机焦磷酸酶、taq酶、taq酶缓冲液、基因扩增引物池；所述基因扩增引物池中的引物及浓度与步骤2的引物池相同。

28、作为优选实施方案，所述步骤4中第一pcr反应的产物和步骤5中的第二pcr反应的产物均采用ampure xp磁珠进行纯化。

29、作为优选实施方案，所述步骤4中第二pcr反应的体系为：taq酶、taq酶缓冲液、带有udi的通用引物。

30、参见图1，为本发明提供的试剂盒预测肺腺癌免疫治疗不良反应的流程示意图。对血浆样本进行过滤后，加入沉淀试剂，然后离心获取沉淀部分，即得到血浆外泌体；采用rna抽提试剂盒提取外泌体中的总rna样本，再针对筛选的7种lncrna标记物设计特异的检测引物，进行ngs建库和数据分析。

31、具体方法过程如下：

32、步骤一：血浆样本的处理和外泌体的纯化。血浆样本于12000g，4℃，离心30min，取上清。然后用0.22μm的滤膜过滤。采用沉淀法获取外泌体，具体步骤如下：取已过滤血浆样本3ml，均分为3管，每管1ml，分别加入250μl沉淀试剂(思路迪，货号a21459)，震荡混匀，3000g，4℃条件下离心10min，弃上清。然后往沉淀中各加入1×pbs缓冲液(ph:7.2)1ml重悬，吹打混匀，重悬液中各加入250μl沉淀试剂(思路迪，货号a21459)，震荡混匀，3000g，4℃，离心10min；弃上清，沉淀分别用100μl 1×pbs缓冲液(ph:7.2)重悬。

33、步骤二：外泌体总rna的提取。将上述外泌体重悬液分别加入适量qiazol lysisreagent(货号：79306)进行处理，然后使用mirneasy micro kit(货号：217804)进行rna抽提，具体操作步骤见试剂盒说明书。外泌体rna提取后，使用agilent rna 6000 pico kit(货号：5067-1513)进行检测，详细操作流程见试剂盒说明书。

34、步骤三：取>15pg的外泌体总rna进行逆转录，逆转录体系为：逆转录酶150u-250u，5×逆转录缓冲液2μl，(10mm)dntp mix 0.5μl，基因扩增引物池1μl(引物池中每条引物的浓度为1μm)，外泌体rna3-5μl，总逆转录体积共10μl。

35、逆转录程序设置：25℃，5min；42℃，15min；85℃，5min。所述基因扩增引物池中的正向引物5’端至3’端依次为：t7启动子序列(如seq id no:1所示)+正向通用序列(seq idno:2所示)+6碱基标签序列(nnnnn(n)-s-t，-s-表示硫代修饰)+靶向基因上游引物/内参基因上游引物。所述基因扩增引物池中的反向引物3’端至5’端依次为：反向通用序列(seq idno:3所示)+6碱基标签序列(nnnnn(n)-p，-p-表示磷酸化修饰)+靶向基因下游引物/内参基因下游引物。t7启动子序列、通用序列、标签序列如表1所示。

36、表1

37、

38、所述基因扩增引物池用于检测以下7种lncrna靶向基因：arap1-as2、tmem161b-as1、zbed5-as1、bace1-as、trim52-as1、gusbp11、wdr11-as1。基因扩增引物池还包含以下内参基因：gapdh、actb。基因设计包括上下游引物，靶向基因、内参基因的上下游引物如表2所示。

39、表2

40、

41、

42、引物合成后，正向引物与反向引物1:1混合，组成基因扩增引物池。

43、步骤四：将逆转录产物cdna进行转录反应，反应体系为：t7 rna聚合酶140u-240u，10×转录缓冲液2μl，(20mm)atp 2μl，(20mm)gtp(20mm)2μl，(20mm)ctp 2μl，(20mm)utp 2μl，共20μl体系；37℃孵育1.5-2h，85℃，5min。

44、步骤五：取转录产物rna 5-10μl进行逆转录及第一pcr反应，逆转录和第一pcr反应于同一体系内进行。逆转录+pcr的反应体系包含：m-mlv逆转录酶、热稳定无机焦磷酸酶、taq酶、taq酶缓冲液、基因扩增引物池。该基因扩增引物池中的引物与步骤三中逆转录反应的引物相同。

45、步骤六：将第一pcr反应用1.4×ampure xp磁珠进行纯化，纯化产物采用带有udi的通用引物进行第二pcr，第二pcr的反应体系包含taq酶、taq酶缓冲液、带有udi的通用引物，udi的通用引物为i5引物(带有i5标签的引物)和i7引物(带有i7标签的引物)，具体见表3(序列中的“c-s-t-”，其中的“-s-”表示其对应的“c”碱基为硫代修饰的碱基)。

46、表3

47、

48、步骤七：将第二pcr产物用1×ampure xp磁珠进行纯化，获得文库。

49、步骤八：将构建好的文库采用pe labchip gx touch进行文库片段分析，经过illumina novaseq 6000测序仪测序，获得原始数据。

50、步骤九：将原始数据首先使用q30值进行原始数据质控。使用cut adapt软件去接头，去低质量reads，获得高质量clean reads。使用bwa软件将clean reads比对到参考基因组上，最后计算出检测结果。

51、本发明中涉及的英文缩写注释如下：

52、dna：脱氧核糖核酸

53、rna：核糖核酸

54、ngs：next generation sequencing，下一代测序技术

55、lncrna：长链非编码核糖核酸

56、pcr：聚合酶链式反应

57、gapdh：甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

58、actb：肌动蛋白β，actinβ

59、udi：唯一标识，unique device identification

60、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

61、1，本发明以血浆外泌体中的rna作为研究对象，通过ngs检测技术对研究对象进行了大量的rna建库和指标筛选，筛选出可以预测免疫治疗后引起不良反应的7种lncrna生物标记物，并对外泌体微量rna文库构建进行优化，研发出基于血浆外泌体lncrna检测来预测肺癌免疫不良反应的试剂盒，为肿瘤患者的免疫治疗过程提供更多的帮助。

62、2，本发明对7种lncrna标记物设计了独特的引物组合，并联合独特的t7启动子序列和标签序列进行转录，增加了rna的表达量。

63、3，本发明的试剂盒通过对外泌体微量rna进行文库构建并对筛选的生物标志物进行检测，从而实现对肺癌免疫不良反应的预测。本发明提供的文库构建方法，通过对逆转录时间的优化和cdna转录反应时间的优化，缩短了建库流程时间，整个建库流程可在7个小时内完成。