一种含特异性分子标签的外泌体微量RNA文库构建方法与流程

本发明属于核酸文库构建，具体涉及一种含特异性分子标签的外泌体微量rna文库构建方法。

背景技术：

1、外泌体是活细胞释放到细胞外的微小囊泡，直径在30-160nm。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，它们广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中，被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。研究表明，外泌体与免疫反应、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中枢神经系统相关疾病、癌症进展有关。外泌体具有细胞类似的拓扑结构，包含dna、rna、蛋白质、脂质和小分子代谢物等物质，这些蛋白、脂质、rna、micorna等组分可作为癌症诊断和预兆。

2、二代测序基于其低成本，高通量的特点，已经成为核酸检测的主流工具。二代测序的难点和核心在于其多种多样的文库构建技术。目前常规的dna或rna文库制备所需的核酸量需达10ng以上，而外泌体核酸基本在5ng以下，且主要为碎片化严重的rna，长度在70bp-200bp，如果采用常规的探针捕获法或多重pcr的方法根本无法建库成功，目前市面上针对外泌体的建库都是外泌体total small rna建库。当前的血浆外泌体微量rna建库的方法为针对血浆total rna的建库，一般采用商品化的试剂盒，如neb公司rna微量建库试剂盒ultratm ii rna library prep kit for illumina，此试剂盒虽然建库成功率较高，但若需要分析具体基因信息，则需高深度大数据量测序(至少20g)，这样则会增加测序成本，且需要一天半时间才能完成建库，建库时间长，不适合于自动化，因此应用于临床的难度大。对外泌体进行定制化基因文库构建并测序是本领域亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是，提供一种含特异性分子标签的外泌体微量rna文库构建方法。主要解决现有技术中外泌体微量核酸建库成功率低的技术问题。

2、本发明为解决上述问题所采用的技术方案如下：

3、一种含特异性分子标签的外泌体微量rna文库构建方法，包括如下步骤：

4、步骤1，采用包含t7启动子序列、通用序列和标签序列的靶向基因特异性引物作为逆转录引物，对外泌体rna进行逆转录1，获得cdna；

5、步骤2，以步骤1中获得的cdna为模板，在t7 rna聚合酶的作用下进行转录反应；

6、步骤3，以步骤2的转录产物rna作为模板进行逆转录2及第一pcr反应，逆转录2和第一pcr反应于同一体系内进行，该第一pcr反应的引物与步骤1中采用的靶向基因特异性引物相同，且反应体系中加入无机焦磷酸酶；

7、步骤4，将步骤3的第一pcr产物纯化，纯化的产物采用含有udi的通用序列引物进行第二pcr反应，然后纯化第二pcr产物，得到文库。

8、作为优选实施方案，所述靶向基因特异性引物包括基因特异性正向引物和基因特异性反向引物；其中，基因特异性正向引物5’端至3’端依次为：t7启动子序列、正向通用序列、正向标签序列、靶向基因上游引物序列；基因特异性反向引物3’端至5’端依次为：反向通用序列、反向标签序列、靶向基因下游引物序列。

9、作为优选实施方案，所述正向标签序列为6碱基标签序列nnnnn(n)-s-t，(n)-s-表示该碱基为硫代修饰，所述反向标签序列为6碱基标签序列nnnnn(n)-p，(n)-p表示该碱基为磷酸化修饰。

10、作为优选实施方案，所述t7启动子序列如seq id no.1所示，所述正向通用序列如seq id no.2所示，所述反向通用序列如seq id no.3所示。

11、作为优选实施方案，所述靶向基因选自融合基因alk、ros1、ret、met、ntrk1、ntrk3中的一种或多种；所述靶向基因特异性引物为一种或多种靶向基因引物的混合物。

12、作为优选实施方案，所述融合基因的上下游引物分别设计在融合断点两侧的驱动基因和所述驱动基因融合的另一基因的转录区域中，使得融合发生时能够扩增出所述融合基因断点区域而融合未发生时不能扩增出所述融合基因的断点区域。

13、作为优选实施方案，针对融合基因alk、ros1、ret、met、ntrk1、ntrk3设计的引物如下：

14、针对alk融合基因的上下游引物对如seq id no.4/seq id no.31，seq id no.5/seq id no.32，seq id no.6/seq id no.33所示；

15、针对ros1融合基因的上下游引物对如seq id no.7/seq id no.34，seq id no.8/seq id no.35所示；

16、针对ret融合基因的上下游引物如seq id no.9/seq id no.36，seq id no.10/seq id no.37，seq id no.11/seq id no.38所示；

17、针对met融合基因的上下游引物如seq id no.12/seq id no.39，seq id no.13/seq id no.40，seq id no.14/seq id no.41所示；

18、针对ntrk1融合基因的上下游引物如seq id no.15/seq id no.42，seq idno.16/seq id no.43，seq id no.17/seq id no.44，seq id no.18/seq id no.45，seq idno.19/seq id no.46，seq id no.20/seq id no.47所示；

19、针对ntrk3融合基因的上下游引物如seq id no.21/seq id no.48，seq idno.22/seq id no.49，seq id no.23/seq id no.50，seq id no.24/seq id no.51所示。

20、作为优选实施方案，所述步骤1中外泌体rna的量为≥10pg。

21、作为优选实施方案，所述步骤1中的逆转录引物还包括内参基因引物。

22、作为优选实施方案，所述内参基因选自gapdh、rps18、tbp、b2m、hprt、actb中的一种或多种。

23、作为优选实施方案，检测所述内参基因的引物为以下至少其一的引物对：

24、针对内参基因gapdh基因的上下游引物如seq id no.25/seq id no.52所示；

25、针对内参基因rps18基因的上下游引物如seq id no.26/seq id no.53所示；

26、针对内参基因tbp基因的上下游引物如seq id no.27/seq id no.54所示；

27、针对内参基因b2m基因的上下游引物如seq id no.28/seq id no.55所示；

28、针对内参基因hprt基因的上下游引物如seq id no.29/seq id no.56所示；

29、针对内参基因actb基因的上下游引物如seq id no.30/seq id no.57所示。

30、作为优选实施方案，所述步骤1的逆转录反应体系包括：逆转录酶100u-200u，逆转录缓冲液，dntp mix终浓度0.1-1mm，靶向基因特异性引物终浓度0.05-0.5μm，外泌体rna10-1000pg。

31、作为优选实施方案，所述步骤2的转录反应体系包括：t7 rna聚合酶30-70u，转录缓冲液，atp 1-3mm，gtp 1-3mm，ctp 1-3mm，utp 1-3mm。

32、作为优选实施方案，所述步骤3的逆转录2及第一pcr反应的体系包括：m-mlv逆转录酶100-200u、热稳定无机焦磷酸酶2-10u、taq酶100-200u、taq酶缓冲液、dntp mix终浓度0.5-2mm，靶向基因特异性引物终浓度0.05-1μm。

33、作为优选实施方案，所述步骤4的第二pcr反应的体系包括：热稳定无机焦磷酸酶2-10u、taq酶100-200u、taq酶缓冲液、含有udi的通用序列引物终浓度0.05-0.1mm。

34、作为优选实施方案，所述步骤4中将第一pcr反应产物用1.2×ampure xp磁珠进行纯化。

35、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

36、本发明的目的在于通过对血浆外泌体微量rna逆转录时引入t7启动子序列和标签序列，在t7 rna聚合酶的作用下转录大量的rna，将rna的量放大至微克级，将转录后的rna进行一链合成和第一pcr扩增，随后第一pcr产物纯化，将纯化的产物采用含有udi的通用引物进行第二pcr扩增，随后第二pcr产物纯化，得到纯化的文库以作为后续分析。此建库方法可以设计靶向基因特异性引物，针对特定的某个或某组基因进行建库，建库过程中将rna的量放大至微克级，保障了后续建库的成功，并且在逆转录时就引入了标签序列，即使后续的转录和逆转录过程中产生错配碱基，也能在数据分析时将之识别出，极大的提高了检测的灵敏度，整个建库过程只需6小时就可完成，操作简单，适合于自动化建库。

37、本发明的优势在于：(1)将标签序列设计在逆转录引物上，极大减少了后续在逆转录、转录、基因扩增时引入的碱基错配；(2)将靶向基因特异性引物和t7 rna聚合酶应用于外泌体rna建库过程中，并优化了转录体系，提高了转录效率；(3)将逆转录2和第一pcr扩增于一管内进行，特异的添加了热稳定无机焦磷酸酶，增加了逆转录和pcr的效率，缩短了实验流程；(4)解决了外泌体短片段rna的靶向基因建库成功率低的问题。