一种在马克斯克鲁维酵母菌株中表达外源基因的重组载体

1.本发明属于基因工程领域，具体涉及一种在马克斯克鲁维酵母菌株中表达外源基因的重组载体。


背景技术：

2.随着基因工程技术、分子生物学技术的不断发展，目前，已出现了多种用于表达外源基因的蛋白表达系统，目前常用的包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。原核表达技术以大肠杆菌表达系统为代表，具备遗传背景清楚、成本低、表达量高、产物分离纯化简单等优势，目前已十分成熟。因此，利用真核表达系统来表达蛋白越来越受到研究人员的重视。
3.昆虫、哺乳动物细胞表达系统的基因产物真实性好，但操作困难、产率低、成本高，不适于大规模生产；因此，以酵母表达系统为主的真核表达系统逐渐成为基础研究和工业生产的重要工具。
4.目前，常用的酵母表达系统以瞬时表达系统——酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和稳定表达系统——毕赤酵母(pichia pastoris)为典型代表。酿酒酵母生长密度低，不易于大规模发酵，分泌30kda以上分子量的能力弱，生长周期长。毕赤酵母需要利用甲醇进行诱导表达，发酵过程存在危险因素，生长周期长。因此，发展生长周期短、蛋白表达量高和安全性高的酵母表达系统具有潜在工业价值。
5.马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)属于酵母科克鲁维属，是一种食品安全级酵母，具有生长快、耐高温等多种生理生化特点，目前利用基因工程技术，已经实现了数种外源蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达，例如α-半乳糖苷酶、乳糖脱氢酶、耐热纤维素酶等(郭超,陈勇毅,周峻岗,等.一种针对马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)的无痕基因组改造方法[j].复旦学报(自然科学版),2016,55(5):576-586.)，在外源蛋白的表达中表现出很好的潜力。
[0006]
氧化酶对化工、医药重要化合物的绿色合成具有重要意义，目前，尚未有报道表明马克斯克鲁维酵母能表达出具有活性的氧化酶。因此，开发基于马克斯克鲁维酵母系统，用于表达有活性的氧化酶具有潜在的价值。
[0007]
对于马克斯克鲁维酵母这种新型的表达系统而言，目前对其生理特性、遗传特性的研究程度还有限，能够用于外源基因表达的重组载体的报道也较少；且现有报道的在马克斯克鲁维酵母菌株中表达外源基因的重组载体均设计类型和种类均有限，例如专利申请cn105063082a、cn105063081a、cn105132452a、cn105063080a等公开的重组载体，均基于pkd1片段设计。
[0008]
因此，研发新型的，能够在马克斯克鲁维酵母菌株中高效表达氧化酶的重组载体，值得进一步探索。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的在于提供一种在马克斯克鲁维酵母菌株中表达外源基因的重组载体。
[0010]
本发明提供了一种载体，含有顺序连接的如下片段：营养基因a、cyc终止子、tef3启动子、复制子、抗性基因；
[0011]
所述tef3启动子的序列如seq id no.2所示；
[0012]
所述cyc终止子的序列如seq id no.4所示；
[0013]
所述营养基因a的序列如seq id no.5所示；
[0014]
所述复制子的序列如seq id no.7所示；
[0015]
其中，cyc终止子、tef3启动子、复制子、抗性基因反向连接。
[0016]
进一步地，上述抗性基因是氨苄霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因或氯霉素抗性基因，优选为氨苄霉素抗性基因，序列如seq id no.6所示。
[0017]
进一步地，上述营养基因a和cyc终止子之间连接有seq id no.8所示序列；
[0018]
和/或所述cyc终止子和tef3启动子之间连接有seq id no.9所示序列；
[0019]
和/或所述tef3启动子和复制子之间连接有seq id no.10所示序列；
[0020]
和/或所述复制子和抗性基因之间连接有seq id no.11所示序列；
[0021]
和/或所述抗性基因和营养基因a之间连接有seq id no.12所示序列；
[0022]
优选地，所述重组载体的序列如seq id no.13所示。
[0023]
本发明还提供了上述的载体用在马克斯克鲁维酵母菌中表达外源基因的应用，优选地，所述外源基因是氧化酶基因a。
[0024]
本发明还提供了一种重组载体，它是含有目标基因的上述的载体。
[0025]
进一步地，上述目标基因是氧化酶基因a，所述重组载体含有顺序连接的如下片段：营养基因a、cyc终止子、氧化酶基因a、tef3启动子、复制子、抗性基因；所述氧化酶基因a的序列如seq id no.3所示，且所述氧化酶基因a反向连接。
[0026]
进一步地，上述cyc终止子和氧化酶基因a之间连接有seq id no.9所示序列；
[0027]
优选地，所述重组载体的序列如seq id no.1所示。
[0028]
本发明还提供了上述的重组载体在制备重组马克斯克鲁维酵母菌中的应用；优选地，所述马克斯克鲁维酵母菌是ura3营养缺陷型马克斯克鲁维酵母菌。
[0029]
本发明还提供了一种重组菌，它是包含上述的重组载体的马克斯克鲁维酵母菌；优选地，所述马克斯克鲁维酵母菌是ura3营养缺陷型马克斯克鲁维酵母菌。
[0030]
本发明还提供了上述的重组菌制备氧化酶a蛋白的用途。
[0031]
本发明选择氧化酶a作为表达对象。
[0032]
本发明术语解释说明：“反向连接”：本发明说明书中给出的各片段序列均是以5
’→
_3’端的方向表示的。权利要求书中限定“反向连接”则意味着该片段插入载体中的方向与说明书所给出的片段序列方向相反，即在载体中表示为其反向互补序列。
[0033]
本发明的有益效果：本发明提供了一种能够成功在马克斯克鲁维酵母菌株中复制和表达外源基因的重组载体，能够稳定、高效地生产氧化酶a蛋白，具有工业化推广应用的价值。
[0034]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离
本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0035]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0036]
图1为重组载体psus1tpc的图谱。
[0037]
图2为重组载体pkups6npc的图谱。
[0038]
图3为蛋白标准品聚丙烯酰胺凝胶电泳结果示意图(左)和重组载体psus1tpc和重组载体pkups6npc表达蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果(右)。
[0039]
图4为重组载体psus1tpc和重组载体pkups6npc表达氧化酶a蛋白的活性检测。
具体实施方式
[0040]
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。本发明载体均委托成都擎科生物公司合成。
[0041]
本发明实施例所用ura3营养缺陷型马克斯克鲁维酵母是利用同源重组技术将马克斯克鲁维酵母cbs6556中ura3基因的一段168bp长度的cds敲除，构建的ura3营养缺陷型菌株，方法参照文献：lobs a k,engel r,schwartz c,et al.crispr
–
cas9-enabled genetic disruptions for understanding ethanol and ethyl acetate biosynthesis in kluyveromyces marxianus[j].biotechnology for biofuels,2017,10(1).(doi：10.1186/s13068-017-0854-5)。
[0042]
实施例1、本发明重组载体的构建
[0043]
全基因合成重组载体psus1tpc，如图1所示，
[0044]
序列如下(seq id no.1)：
[0045]
gccaagcttgcatgcatcactaatgaaaagcatacgacgcctggagctcctttcatttctgataaaagtaaggtttctctatttatcttttcacccacattatccttcgaagtacgtatacaatattagttcaacgtaaaaacaaaacttactgtaaatatgcgtaaaaaaaatctattaaattcatagcagtttcaaggaaagagaaccattatggtctggtcacgtgtgtataaattattaattttaacactatataatttattatttttttattttgaagtttagagtaattttagtagtattttatattttaaataaatatattttaaatttttacttaatattttattatttttaatacaatgtttttatttaaaacaaaattataaattaaaatgttgttccgaaagtaaaatatattttatggttttacaaaaataaattatttttaatgtattttttaattatattttgtatgtaattatatccacaggtattatgttgaatttagctgttttagtttacctgtgtggtactatgagttttgcctctcaaaagctatttttagaactctctctctcttagaaataggtggtgttgcggttgacttttaacgatatatcattttcaatttatttattttaaagtgacatagagagattccttttaatttttaatttttattttcaataattttaaaatggggacttttagattggaacaaaatgaaaatatctgttatacgtgcaactgaattttactgaccttaaaggactatctcgaacttggttcggaaatccttgaaatgattgatattttggtggattttctctgattttcaaacaagtagtattttatttaatatttattatattttttacatttttttatatttttttattgtttggaagggaaagcaacaattactttcaaaatatataaattaaactgaaatacttaataagagacaaataacattcaagaatcaaatactgggttattaatcaaaagatctctctacatgcacccaaattcactatttaaatttactataccactgacagaatatatgaacccagattaagtagccagaggctcttccactatattgagtatatagccttacata
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[0046]
其中，涉及的主要功能片段序列如下：
[0047]
tef3启动子的序列(seq id no.2)：
[0048]5’‑
aacaccgatgaagcaaagaagtaacagcaggaaagaaaaacaaacacaacaaaaaaaaacaagcagcatagcatcaacagaaatttctaaagagaaccaaattcaccccagaaacaaccgcacaaatacgacatccatccacctttcttttatcttctttttctgatctgataattagtttcatatacaatacgtagaaacaggcgcacagcacccagacctggcttctgccccagtgtataagcaatgtagcataattggaaaaaaaaacgaaaaataccgaaaataagtgggaagctgggccacaggagtggggcgggatgcgactggttctgagcgggaccgggtaataaggttgaaaaactttgaattgatggaataagtaacttctttcttttcgctggcgggagaaggaaaaaaaaaaattttttttccttctgtttagtactgggacattgagaaggcgtgtcaattttgaataattagagtggtcaaaaaaattttttttgcttgggataccctttttcgataatgtaaattttttttgaatataaaaggagattgaaaaattttttctagcagaaatgttttcaagttttaattgcaagtttcgtttgagtattcagttgtattttagttgatttgtagtttatttactagtattctcatagttctaactccaagagaagtaacattaaag-3’[0049]
氧化酶基因a的序列(seq id no.3)：
[0050]5’‑
atgaaatattttcccctgttcccaaccttggtctacgcagtgggggtcgttgcttttcctgactacgcctcattggccggcctcagccagcaggaattggacgctataatcccaacactcgaggcccgagagccaggattacctcctggtcctctcgagaatagctctgcaaagttggtgaacgacgaggctcacccatggaagccgcttcgacctggcgatattcgtggaccttgccctggtctcaatactctggcatctcacgggtacctcccgagaaatggcgttgcaaccccggcgcaaataataaacgcggttcaggaaggattcaatttcgacaatcaagccgcaatcttcgccacatatgcggcccaccttgtggacggcaatctcattacggacttgctgagcatcggacgcaagacgcggctcactgggcctgatccaccaccccccgcttccgttggtggactcaatgagcatggcaccttcgaaggcgacgccagtatgacccgaggtgacgcattctttggcaacaaccacgatttcaatgagacgctcttcgaacagttggttgactacagcaaccgatttggaggaggaaaatacaatcttaccgtcgcgggggagctccgtttcaagcgcattcaagactccattgcgaccaaccccaatttctcctttgttgactttaggttctttactgcttacggcgagaccaccttccccgcgaatctttttgtggatgggcgcagggacgacggccagctagatatggatgctgcacggagttttttccaattcagccgtatgcctgacgatttcttccgcgcacccagcccgagaagtggcacaggagtcgaggtagttgtacaggctcatcctatgcagcccggaagaaatgtcggcaagatcaacagctacaccgtcgacccaacatcctctgacttttccaccccctgcttgatgtacgagaaattcgtcaacataacggtcaagtcactctacccgaatccgacggtgcagcttcgcaaagcccttaatacgaatctcgatttcttattccagggagtcgccgctggatgtacccaggtcttcccatacgggcgagat-3’[0051]
cyc终止子的序列(seq id no.4)：
[0052]5’‑
tcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgc-3’[0053]
营养基因a的序列(seq id no.5)：
[0054]5’‑
ttcaattcatcattttttttttattcttttttttgatttcggtttctttgaaatttttttgattcggtaatctccgaacagaaggaagaacgaaggaaggagcacagacttagattggtatatatacgcatatgtagtgttgaagaaacatgaaattgcccagtattcttaacccaactgcacagaacaaaaacctgcaggaaacgaagataaatcatgtcgaaagctacatataaggaacgtgctgctactcatcctagtcctgttgctgccaagctatttaatatcatgcacgaaaagcaaacaaacttgtgtgcttcattggatgttcgtaccaccaaggaattactggagttagttgaagcattaggtcccaaaatttgtttactaaaaacacatgtggatatcttgactgatttttccatggagggcacagttaagccgctaaaggcattatccgccaagtacaattttttactcttcgaagacagaaaatttgctgacattggtaatacagtcaaattgcagtactctgcgggtgtatacagaatagcagaatgggcagacattacgaatgcacacggtgtggtgggcccaggtattgttagcggtttgaagcaggcggcagaagaagtaacaaaggaacctagaggccttttgatgttagcagaattgtcatgcaagggctccctatctactggagaatatactaagggtactgttgacattgcgaagagcgacaaagattttgttatcggctttattgctcaaagagacatgggtggaagagatgaaggttacgattggttgattatgacacccggtgtgggtttagatgacaagggagacgcattgggtcaacagtatagaaccgtggatgatgtggtctctacaggatctgacattattattgttggaagaggactatttgcaaagggaagggatgctaaggtagagggtgaacgttacagaaaagcaggctgggaagcatatttgagaagatgcggccagcaaaactaa-3’[0055]
氨苄霉素抗性基因的序列(seq id no.6)：
[0056]5’‑
atgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaa-3’[0057]
复制子的序列(seq id no.7)：
[0058]5’‑
ttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggta
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其中，营养基因a和cyc终止子通过如下序列(seq id no.8)连接：
[0060]
aaaactgtattataagtaaatgcatgtatactaaactcacaaattagagcttcaatttaattatatcagttattacccattgaaaaaggaagagtgggtaccgagctcgaattcgcacatttctgcgcgc
[0061]
cyc终止子和氧化酶基因a通过如下序列(seq id no.9)连接：
[0062]
tgcggccctctaggatcagcgggtttaaactcaatggtgatggtgatgatgaccggtacgcgtagaatcgagaccgaggagagggttagggataggcttaccttcgaagggccctctagattaatgatgatgatgatgatg
[0063]
氧化酶基因a和tef3启动子首尾连接
[0064]
复制子和tef3启动子通过如下序列(seq id no.10)连接：
[0065]
gtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtt
[0066]
氨苄抗性基因和复制子通过如下序列(seq id no.11)连接：
[0067]
gaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacag
[0068]
氨苄抗性基因和营养基因a通过如下序列(seq id no.12)连接：
[0069]
actcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccataaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagcccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacccaaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtactatggttgctttgacgtatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagcttgcatgcatcactaatgaaaagcatacgacgcctggagctcctttcatttctgataaaagtaaggtttctctatttatcttttcacccacattatccttcgaagtacgtatacaatattagttcaacgtaaaaacaaaacttactgtaaatatgcgtaaaaaaaatctattaaattcatagcagtttcaaggaaagagaaccattatggtctggtcacgtgtgtataaattattaattttaacactatataatttattatttttttattttgaagtttaga
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[0070]
实施例2、本发明重组菌的构建和氧化酶a蛋白的生产
[0071]
将实施例1制备的重组载体psus1tpc转入到ura3营养缺陷型马克斯克鲁维酵母中。
[0072]
挑取单菌落，用yp液体培养基(酵母提取物1％，蛋白胨2％)于30℃，200rpm培养24-48h，用葡聚糖酶处理酵母细胞壁，8000rpm离心5min后，获得培养液上清，即含有氧化酶a。
[0073]
实施例3、本发明不含有目标基因的载体
[0074]
实施例1中的目标基因：氧化酶a基因可以替换为其他目标基因，不影响载体在马克斯克鲁维酵母中表达外源基因的能力。
[0075]
本发明不含目标基因的空载体序列如下(seq id no.13)，即在实施例1的重组载体序列中去掉氧化酶a基因序列，cyc终止子和tef3启动子直接通过seq id no.9所示序列相连。
[0076]
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[0077]
对比例1、重组载体pkups6npc
[0078]
构建序列如下(seq id no.14)的重组载体pkups6npc，如图2所示：
[0079]
gccaagcttgcatgcatcactaatgaaaagcatacgacgcctggagctcctttctgatccaagtctga
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[0080]
并参照实施例2的方法培养获得培养液上清。
[0081]
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0082]
实验例1、本发明重组载体在马克斯克鲁维酵母菌株中表达氧化酶基因
[0083]
1、实验方法
[0084]
(1)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法验证实施例2、对比例1的重组载体表达的蛋白分子量，其中所用蛋白标准品(marker)是上海生工产品，货号c520010，示意图如图3(左)。
[0085]
(2)取实施例2、对比例1的培养液上清100μl，0.3mm的abts(2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，1mm的过氧化氢，用ph 4.2柠檬酸-磷酸盐缓冲液补至1ml室温反应5min，验证氧化酶a蛋白的活性。
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2、实验结果
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(1)氧化酶a蛋白的分子量理论值为41kda，而根据图3(右)所示结果，本发明实施例1的psus1npc重组载体可以成功表达分子量在40kda-50kda之间的蛋白，对比例1的pkups6npc未能表达分子量在40kda-50kda之间的蛋白。证明本发明重组载体能够成功表达氧化酶a蛋白。
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(2)结果如图4所示，可以看到，可以看到，本发明实施例1的psus1tpc重组载体相比于对比例1的pkups6npc重组载体，具有显著更高的蛋白活性。
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以上结果说明本发明重组载体是一种可以成功、高效在马克斯克鲁维酵母菌株中复制和表达外源基因的重组载体。
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综上，本发明提供了一种够成功在马克斯克鲁维酵母菌株中复制和表达外源基因的重组载体，能够稳定、高效地生产氧化酶a蛋白，具有工业化推广应用的价值。