一种酶解柑橘果汁苦味物质的酶制剂的制备方法及其应用

本发明属于酶制剂，具体的说涉及一种酶解柑橘果汁苦味物质的酶制剂的制备方法及其应用。

背景技术：

1、柑橘中的苦味物质主要包括两大类，一类是类黄酮物质，包括柚皮苷、新橙皮苷、枳属苷、橘皮素、川陈皮苷、槲皮素等，其中柚皮苷含量最高，是最主要的黄烷酮糖苷类苦味物质。另一类为高度氧化的三萜化合物——柠檬苦素类似物，其中柠檬苦素是主要致苦物质。柑橘类果实中主要的苦味物质，柚皮苷和柠檬苦素，在柚类中含量最高，然后依次为葡萄柚、柑类或杂柑类、橘类、脐橙类和普通甜橙类。柑橘类水果中存在的这些天然苦味物质在加工过程中，出现的“延迟苦味”或“后苦味”严重制约了其加工业的发展，是目前柑橘加工业所面临的巨大挑战之一。因此，工业上，必须对柑橘类水果进行脱苦，提高其加工制品的质量。

2、柠檬苦素(limonin)，是柑橘类水果出现苦味和“后苦味”的主要物质，极大地影响了柑橘汁的口感。柠檬苦素又称柠碱，是一种三萜化合物，在水溶液中的苦味阈值为1.0mg/kg，在果汁中的苦味阈值为3.4mg/l，约为柚皮苷的20倍。柠檬苦素在鲜果或鲜榨果汁中含量较低，多以无苦味的柠檬苦素a-环内酯存在于细胞质内，但长时间放置或热处理等会使其苦味加剧。这种“后苦味”现象是由于在酸性条件(ph<6.5)下，柠檬苦素a-环内酯在柠檬苦素d-环内酯水解酶催化下转化为有苦味的柠檬苦素。果肉组织在冰冻、机械损伤或热处理等条件下，其酸度均会增强，进而促进了加工或贮藏过程中柠檬苦素的生成。

3、

4、柚皮苷的酶解原理如下：

5、

6、水解柚皮苷主要分两步完成，柚皮苷(4'-5,7'-三羟基二氢黄酮-7-鼠李糖葡萄糖苷)被鼠李糖苷酶水解为鼠李糖和普鲁宁，普鲁宁的苦味约为柚皮苷的三分之一；普鲁宁又在β-d-葡萄糖苷酶的作用下被水解为无苦味的柚皮素和葡萄糖。

7、由上述可知，对于柠檬苦素和柚皮苷的酶解原理是完全不同的。

8、目前报道的用于果汁脱苦的方法有β-环糊精法、超临界co2法、膜分离法、添加苦味抑制剂、生物酶法等。相较于其他脱苦法，生物酶法不仅具有效果好、无污染、工艺简单、反应条件温和等特点，而且其酶解产物一定程度上还能增强果汁风味，保留果汁营养成分，更适用于工业化生产。生物酶法在柑橘加工业中之所以未得到广泛应用，其主要原因是缺乏高活性的酶制剂产品，因此制备出性能稳定、活性高的酶制剂至关重要。目前市场上销售的柚苷酶粉剂，其作用底物仅为柚皮苷，对柠檬苦素和诺米林苦味物几乎无作用，且活力仅为0.1-0.4u/ml。纯的柚苷酶以前可以从国外进口，但是近几年，国外几大酶制剂公司也没有现货，需要提前半年以上的订制，且价格昂贵，非常受限。

9、中国专利cn104404016b公布了一种生产柚苷酶的方法，采用传统的液体发酵方法，得到的柚苷酶活力不高，且热稳定性仅为45℃。中国专利cn101914451a公布了一种从链格孢菌生产α-l-鼠李糖苷酶的方法，链格孢菌所产的α-l-鼠李糖苷酶为胞内酶，需要从细胞中分离提取，后续分离纯化困难，直接导致了使用成本较高。中国专利cn105441410a公布了一种来源于细丽毛壳菌种的鼠李糖苷酶的生产方法，得到的酶活力为500u/ml，但是并未对底物特异性进行研究。这些研究成果体现了近年来α-l-鼠李糖苷酶或柚苷酶的研究深受人们的关注，但是对于具有复合脱苦酶特性的酶制剂的研究却很少涉及。

技术实现思路

1、本发明提出一种酶解柑橘果汁苦味物质的酶制剂的制备方法及其应用，能够同时酶解柑橘果汁苦味物质——柠檬苦素和柚皮苷的酶制剂的方法。

2、为达到上述目的，本发明采用以下技术方案为：

3、一种塔宾曲霉，所述塔宾曲霉名称为塔宾曲霉ua13，aspergillus tubingensisua13，于2022年06月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m20222989，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。

4、优选地，塔宾曲霉应用于发酵法制备柠檬苦素脱苦酶。

5、进一步优选地，所述应用为在塔宾曲霉的发酵培养基中加入柠檬苦素或含有柠檬苦素的柠檬皮粉，柠檬苦素加入量为4.0-6.0mg/l。

6、柠檬皮粉的制备：新鲜柠檬皮去掉白色囊衣层，切片后烘干，再磨粉至100目备用。

7、进一步优选地，所述培养基包括发酵培养基，发酵培养基中：mgso4·7h2o 0.40-0.60g/l，kh2po4 1.20-1.80g/l，k2hpo4 1.20-1.80g/l，(nh4)2so4 3.50-4.50g/l，znso4·7h2o 0.05-0.15g/l，cacl2 0.05-0.15g/l，酵母提取物0.80-1.20g/l，豆粉1.50-2.50g/l，蛋白胨1.50-2.50g/l，柠檬苦素4.00-5.00mg/l，自然ph。

8、再进一步优选地，发酵培养基中：

9、mgso4·7h2o 0.50g/l，kh2po4 1.50g/l，k2hpo4 1.50g/l，(nh4)2so4 4.00g/l，znso4·7h2o 0.10g/l，cacl2 0.10g/l，酵母提取物1.00g/l，豆粉2.00g/l，蛋白胨2.00g/l，柠檬苦素4.00mg/l。

10、所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柠檬苦素的复合酶制剂的制备中的应用，

11、所述应用包括：

12、固体平板培养基：mgso4·7h2o 0.80-1.20g/l，kh2po4 0.80-1.20g/l，(nh4)2so41.30-1.70g/l，kcl 0.30-0.80g/l，kno3 1.20-1.70g/l，cacl2 0.05-0.15g/l，酵母提取物1.50-2.50g/l，柠檬苦素0.50-1.50mg/l，琼脂粉8.00-12.00g/l，自然ph；

13、种子培养基：柠檬苦素3.50-4.50mg/l，mgso4·7h2o 4.00-6.00g/l，k2hpo4 4.00-7.00g/l，kcl 4.00-6.00g/l，feso4·5h2o 0.05-0.15g/l，自然ph；

14、发酵培养基中：mgso4·7h2o 0.40-0.60g/l，kh2po4 1.20-1.80g/l，k2hpo4 1.20-1.80g/l，(nh4)2so4 3.50-4.50g/l，znso4·7h2o 0.05-0.15g/l，cacl2 0.05-0.15g/l，酵母提取物0.80-1.20g/l，豆粉1.50-2.50g/l，蛋白胨1.50-2.50g/l，柠檬苦素4.00-5.00mg/l；

15、固体平板培养基、种子培养基和发酵培养基，依次扩大培养。

16、所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柚皮苷的复合酶制剂的制备中的应用，其所述应用包括：

17、在固体平板培养基中加入柚皮粉8.00-12.00g/l或柚皮苷4.00-6.00g/l，种子培养基组分中加入柚皮粉8.00-12.00g/l，发酵培养基中加入柚皮粉8.00-12.00g/l或柚皮苷4.00-6.00g/l；培养基其他组分分别为：

18、固体平板培养基：mgso4·7h2o 0.80-1.20g/l，kh2po4 0.80-1.20g/l，(nh4)2so41.30-1.70g/l，kcl 0.30-0.80g/l，kno3 1.20-1.70g/l，cacl2 0.05-0.15g/l，酵母提取物1.50-2.50g/l，琼脂粉8.00-12.00g/l，自然ph；

19、种子培养基：mgso4·7h2o 4.00-6.00g/l，k2hpo4 4.00-7.00g/l，kcl 4.00-6.00g/l，feso4·5h2o 0.05-0.15g/l，自然ph；

20、发酵培养基中：mgso4·7h2o 0.40-0.60g/l，kh2po4 1.20-1.80g/l，k2hpo4 1.20-1.80g/l，(nh4)2so4 3.50-4.5 0g/l，znso4·7h2o 0.05-0.15g/l，cacl2 0.05-0.15g/l，酵母提取物0.80-1.20g/l，豆粉1.50-2.50g/l，蛋白胨1.50-2.50g/l。

21、固体平板培养基、种子培养基和发酵培养基，依次扩大培养。

22、柚皮粉的制备：新鲜柚子皮去掉白色囊衣层，切片后烘干，再磨粉至100目备用。

23、培养条件：在初始ph值5.0-6.0下进行液体发酵，培养温度30-35℃，通气量1.3-2.5min/l，搅拌转速250-300rpm下发酵70-77h，可获得最大酶活力的复合酶发酵液。

24、所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柠檬苦素类的复合酶制剂的制备中的应用，其所述应用包括：

25、在固体平板培养基中加入柠檬皮粉8.00-12.00g/l或柠檬苦素4.00-6.00g/l，种子培养基组分中加入柠檬皮粉8.00-12.00g/l，发酵培养基中加入柠檬皮粉8.00-12.00g/l或柠檬苦素4.00-6.00g/l；

26、培养基其他组分分别为：

27、固体平板培养基：mgso4·7h2o 0.80-1.20g/l，kh2po4 0.80-1.20g/l，(nh4)2so41.30-1.70g/l，kcl 0.30-0.80g/l，kno3 1.20-1.70g/l，cacl2 0.05-0.15g/l，酵母提取物1.50-2.50g/l，琼脂粉8.00-12.00g/l，自然ph；

28、种子培养基：mgso4·7h2o 4.00-6.00g/l，k2hpo4 4.00-7.00g/l，kcl 4.00-6.00g/l，feso4·5h2o 0.05-0.15g/l，自然ph；

29、发酵培养基中：mgso4·7h2o 0.40-0.60g/l，kh2po4 1.20-1.80g/l，k2hpo4 1.20-1.80g/l，(nh4)2so4 3.50-4.50g/l，znso4·7h2o 0.05-0.15g/l，cacl2 0.05-0.15g/l，酵母提取物0.80-1.20g/l，豆粉1.50-2.50g/l，蛋白胨1.50-2.50g/l。

30、固体平板培养基、种子培养基和发酵培养基，依次扩大培养。

31、柠檬皮粉的制备：新鲜的柠檬皮切片后烘干，再磨粉至100目备用；

32、培养条件：在初始ph值5.0-6.0下进行液体发酵，培养温度31-34℃，通气量1.3-1.8min/l，搅拌转速250-280rpm下发酵70-76h，可获得最大酶活力的复合酶发酵液。

33、所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柚皮苷和柠檬苦素的复合酶制剂的制备中的应用，所述应用包括：

34、在固体平板培养基中加入柚皮粉8.00-12.00g/l或柚皮苷4.00-6.00g/l，种子培养基组分中加入柠檬皮粉8.00-12.00g/l，发酵培养基中加入柠檬皮粉8.00-12.00g/l；

35、培养基其他组分分别为：

36、固体平板培养基：mgso4·7h2o 0.80-1.20g/l，kh2po4 0.80-1.20g/l，(nh4)2so41.30-1.70g/l，kcl 0.30-0.80g/l，kno3 1.20-1.70g/l，cacl2 0.05-0.15g/l，酵母提取物1.50-2.50g/l，琼脂粉8.00-12.00g/l，自然ph；

37、种子培养基：mgso4·7h2o 4.00-6.00g/l，k2hpo4 4.00-7.00g/l，kcl 4.00-6.00g/l，feso4·5h2o 0.05-0.15g/l，自然ph；

38、发酵培养基中：mgso4·7h2o 0.40-0.60g/l，kh2po4 1.20-1.80g/l，k2hpo4 1.20-1.80g/l，(nh4)2so4 3.50-4.50g/l，znso4·7h2o 0.05-0.15g/l，cacl2 0.05-0.15g/l，酵母提取物0.80-1.20g/l，豆粉1.50-2.50g/l，蛋白胨1.50-2.50g/l。

39、固体平板培养基、种子培养基和发酵培养基，依次扩大培养。

40、培养条件：培养条件：在初始ph值5.0-6.0下进行液体发酵，培养温度30-35℃，通气量1.3-1.8min/l，搅拌转速250-300rpm下发酵65-75h，可获得最大酶活力的复合酶发酵液。

41、本发明有益效果：

42、1、菌株ua13所产酶对柠檬苦素的亲和力强。同时研究结果显示，柠檬苦素脱苦酶仍能高效水解柚皮苷，即本发明的菌株ua13可以同时酶解柠檬苦素、柚皮苷和橙皮苷，那么该酶在柑橘果汁加工业中就具有了非常好的应用前景。

43、2、柠檬苦素脱苦酶具有良好的耐热性、耐酸性，方便酶制剂的广泛使用，针对不同种类的柑橘类、不同成熟期的柑橘类或者不同的加工条件都可以运用。

44、3、菌株ua13所产酶的底物不管是柠檬苦素类还是柚皮苷，均具有酶解能力，酶解能力根据底物的不同略有不同。

45、4、菌株培养产酶过程中，可根据作用的底物的不同需求，以相应的诱导物诱导酶的生产，从而获得特应性的酶类物质。