一种温度和pH双重响应的可注射自愈水凝胶及其制备方法和应用

一种温度和ph双重响应的可注射自愈水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物材料及生物医学工程技术领域，具体涉及一种温度和ph双重响应的可注射自愈水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.慢性创伤，如皮肤表面灼伤、压力性溃疡、褥疮和糖尿病足等修复过程十分困难，其病理过程常伴有局部温度升高、ph值降低、氧化应激等现象。目前用于慢性创伤修复的水凝胶，其重点主要集中在温度、ph、氧化还原等条件下响应释药，或在单响应条件基础上形成双重或多重响应体系。由于部分慢性创面处于关节等活动范围较大处，且创面往往不规则，采用上述响应性水凝胶进行修复时，可能造成凝胶破裂、水凝胶不能完全贴合创面等问题。
3.自愈合水凝胶是指含有可逆动态交联网络结构的水凝胶，大致可分为两类，一类是通过非共价键形成具有交联网络结构的水凝胶，例如通过氢键、疏水作用、静电作用等形成的水凝胶，由于上述非共价键作用力较弱，导致形成的水凝胶稳定性较差；另一类是通过可逆动态共价键形成的水凝胶，当受到外力作用时，可逆动态共价键被破坏，导致水凝胶断裂，而当外力消失后，该可逆动态共价键又会重新形成，进而重新形成水凝胶。利用该机理，将自愈合水凝胶用于上述慢性创面修复，可解决水凝胶易破裂、不能与创面贴合的问题。但是目前的自愈合水凝胶缺乏对创面病理条件的响应，无法有效释放药物治疗创面。
4.因此，如何使水凝胶同时具有响应性以及自愈合功能以提高慢性创面的修复效果，是急需解决的问题。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种温度和ph双重响应的可注射自愈水凝胶及其制备方法和应用，是将醛基化改性的氧化透明质酸和接枝普郎尼克f127(pluronic-f127，简称f127)的壳寡糖交联形成席夫碱键，通过加入壳寡糖(cs)，增强席夫碱键作用，再通过硼酸与氧化透明质酸之间的氢键共同作用形成可注射水凝胶。
6.本发明具体是通过如下技术方案来实现的。
7.本发明的第一个目的是提供一种温度和ph双重响应的可注射自愈水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
8.s1、以f127和对甲苯磺酰氯为原料，在三乙胺条件下，通过取代反应，制备中间产物；将所述中间产物和壳寡糖通过取代反应，制备接枝f127的壳寡糖；
9.以高碘酸钠为氧化剂，对透明质酸进行氧化，制备氧化透明质酸；
10.s2、冰浴条件下，将s1制备的接枝f127的壳寡糖、氧化透明质酸、壳寡糖和硼酸置于水介质中混匀，制得水凝胶前驱溶液，之后在37℃下孵育，即制得水凝胶。
11.优选的，s2中，接枝f127的壳寡糖和水介质的质量体积比为0.01-0.25g∶1ml，壳寡
糖和水介质的质量体积比为0.001-0.1g∶1ml，硼酸和水介质的质量体积比为0.01-0.1g∶1ml，氧化透明质酸和水介质的质量体积比为0.01-0.1g∶1ml。
12.优选的，s1中，制备中间产物时，溶剂为二氯甲烷；室温反应12-72h。
13.优选的，s1中，制备中间产物时，f127、对甲苯磺酰氯、三乙胺的摩尔比为1∶10-30∶10-40。
14.优选的，s1中，制备接枝f127的壳寡糖时，溶剂为二甲基甲酰胺，50-70℃下反应24-72h。
15.优选的，s1中，制备接枝f127的壳寡糖时，中间产物和壳寡糖的摩尔比为0.2∶0.1-3。
16.优选的，s1中，制备氧化透明质酸时，溶剂为水，室温避光搅拌反应1-8h后，用乙二醇淬火。
17.优选的，s1中，制备氧化透明质酸时，高碘酸钠和透明质酸的用量比为0.25-1mol∶1g。
18.本发明的第二个目的是提供由上述制备方法制得的温度和ph双重响应的可注射自愈水凝胶。
19.本发明的第三个目的是提供温度和ph双重响应的可注射自愈水凝胶在制备慢性创伤修复材料中的应用。
20.本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
21.1、f127是一种由中部疏水的聚氧丙烯链、两端连接两段亲水聚氧乙烯构成的非离子型a-b-a型三嵌段共聚物，其制备的水凝胶具有温度敏感性，且具有良好的生物相容性；壳寡糖是由来源于虾蟹壳的壳聚糖降解成的侧链带有氨基的小分子寡糖，其具备较好的生物降解性、生物相容性；透明质酸是皮肤细胞外基质的主要成分，具备亲水性、保湿性、促进伤口愈合，且易于氧化得到氧化透明质酸；上述原料的选择有利于促进创面愈合；
22.2、本发明通过f127的热可逆性，壳寡糖的氨基和氧化透明质酸的醛基结合形成席夫碱，制备了一种温度和ph双重响应的可注射水凝胶，具体的，是将醛基化改性的氧化透明质酸和接枝f127的壳寡糖交联形成席夫碱键，通过加入壳寡糖，增强席夫碱键作用，再通过硼酸与氧化透明质酸之间的氢键共同作用形成可注射水凝胶；其中，席夫碱中的动态亚胺键使水凝胶具备自修复及可注射功能，通过硼酸与透明质酸之间的氢键作用，降低水凝胶的降解性；
23.3、本发明制备的水凝胶可原位注射，可用于填充不规则的糖尿病足创面，有利于与周围组织进行良好整合；水凝胶中的壳寡糖及透明质酸具备良好的生物相容性及生物降解性，有利于糖尿病足创面的修复；ph响应性可以动态检测创面的酸碱性，起到响应缓释药物的作用；自愈合性则能够在水凝胶断裂之后恢复，提高水凝胶的治疗效果；
24.4、本发明制备水凝胶的方法简单，原料来源广泛，成本低，适合大规模生产应用。
附图说明
25.图1为本发明实施例1制备的水凝胶的自愈合修复效果图；
26.图2为本发明实施例1制备的水凝胶的降解性图；
27.图3为本发明实施例1制备的水凝胶对创面修复效果图(0-14d)；
28.图4为图3创面的he染色结果(0-14d)；
29.图5为图3创面的mt染色结果(0-14d)。
具体实施方式
30.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
31.下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
32.本发明针对慢性创伤修复的特点，将响应性水凝胶和自愈合性水凝胶的特点相结合，制备了一种温度和ph双重响应的可注射自愈水凝胶，制备的水凝胶可原位注射，可用于填充不规则的糖尿病足创面，有利于与周围组织进行良好整合；水凝胶中的壳寡糖及透明质酸具备良好的生物相容性及生物降解性，有利于糖尿病足创面的修复；ph响应性可以动态检测创面的酸碱性，起到响应缓释药物的作用；自愈合性则能够在水凝胶断裂之后恢复，提高水凝胶的治疗效果。
33.下面通过以下实施例对本发明的上述内容进行具体说明。
34.下述实施例中涉及的缩写，具体是指：
35.cs：壳寡糖；
36.f127-cs：接枝f127的壳寡糖；
37.ha：透明质酸；
38.a-ha：氧化透明质酸；
39.ba：硼酸；
40.f127-cs/a-ha+cs+ba水凝胶：温度和ph双重响应的可注射自愈水凝胶。
41.实施例1
42.一种温度和ph双重响应的可注射自愈水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
43.1)制备f127-cs聚合物：
44.将0.5mmol f127溶解于100ml二氯甲烷中，加入5mmol三乙胺和10mmol对甲苯磺酰氯；室温反应24小时后，反应混合液经盐酸和饱和碳酸氢钠清洗，用冰乙醚沉淀，沉淀出的产物经真空干燥后得到中间产物，记为f127-tscl；
45.取0.2mmol f127-tscl溶解于100ml二甲基甲酰胺中，随后加入0.5mmol cs，60℃下反应24小时，产物经8000-14000分子量透析袋纯化3天，真空冷冻干燥得到f127-cs。
46.2)制备a-ha：
47.取ha 1g溶解于100ml去离子水中；0.5mol(5ml)高碘酸钠水溶液缓慢加入到上述溶液中，在室温避光搅拌1小时。加入1ml乙二醇室温下淬火1h，去离子水中透析3天后，经真空冷冻干燥得到产物。
48.3)制备f127-cs/a-ha+cs+ba水凝胶：
49.在步骤1)中获得的f127-cs聚合物中加入cs、ba，用pbs配制成f127-cs聚合物及ba的混合溶液，取步骤2)中获得的a-ha加入混合溶液中，冰浴下剧烈振荡使其混匀，制得水凝胶前驱溶液，后在37℃孵育得到水凝胶；
50.f127-cs和pbs的质量体积比为0.2g∶1ml，壳寡糖和pbs的质量体积比为0.01g∶
1ml，硼酸和pbs的质量体积比为0.04g∶1ml，a-ha和pbs的质量体积比为0.04g∶1ml。
51.实施例2
52.一种温度和ph双重响应的可注射自愈水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
53.1)制备f127-cs聚合物：
54.将0.5mmol f127溶解于100ml二氯甲烷中，加入5mmol三乙胺和5mmol对甲苯磺酰氯；室温反应12小时后，反应混合液经盐酸和饱和碳酸氢钠清洗，用冰乙醚沉淀，沉淀出的产物经真空干燥后得到中间产物，记为f127-tscl；
55.取0.2mmol f127-tscl溶解于100ml二甲基甲酰胺中，随后加入0.1mmol cs，50℃下反应72小时，产物经8000-14000分子量透析袋纯化3天，真空冷冻干燥得到f127-cs。
56.2)制备a-ha：
57.取ha 1g溶解于100ml去离子水中，0.25mol(5ml)高碘酸钠水溶液缓慢加入到上述溶液中，在室温避光搅拌1小时。加入0.5ml乙二醇室温下淬火1h，去离子水中透析3天后，经真空冷冻干燥得到产物。
58.3)制备f127-cs/a-ha+cs+ba水凝胶：
59.在步骤1)中获得的f127-cs聚合物中加入cs、ba，用pbs配制成f127-cs聚合物及ba的混合溶液，取步骤2)中获得的a-ha加入混合溶液中，冰浴下剧烈振荡使其混匀，制得水凝胶前驱溶液，后在37℃孵育得到水凝胶；f127-cs和pbs的质量体积比为0.1g∶1ml，壳寡糖和pbs的质量体积比为0.001g∶1ml，硼酸和pbs的质量体积比为0.04g∶1ml，a-ha和pbs的质量体积比为0.04g∶1ml。
60.实施例3
61.一种温度和ph双重响应的可注射自愈水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
62.1)制备f127-cs聚合物：
63.将0.5mmol f127溶解于100ml二氯甲烷中，加入10mmol三乙胺和10mmol对甲苯磺酰氯。室温反应48小时后，反应混合液经盐酸和饱和碳酸氢钠清洗，用冰乙醚沉淀，沉淀出的产物经真空干燥后得到f127-tscl；
64.取0.2mmol f127-tscl溶解于100ml二甲基甲酰胺中，随后加入1mmol cs，65℃下反应48小时，产物经8000-14000分子量透析袋纯化3天，真空冷冻干燥得到f127-cs。
65.2)制备a-ha：
66.取ha 1g溶解于200ml去离子水中，0.5mol(5ml)高碘酸钠水溶液缓慢加入到上述溶液中，在室温避光搅拌4小时。加入1ml乙二醇室温下淬火4h，去离子水中透析3天后，经真空冷冻干燥得到产物。
67.3)制备f127-cs/a-ha+cs+ba水凝胶：
68.在步骤1)中获得的f127-cs聚合物中加入cs、ba，用pbs配制成f127-cs聚合物及ba的混合溶液，取步骤2)中获得的a-ha加入混合溶液中，冰浴下剧烈振荡使其混匀，制得水凝胶前驱溶液，后在37℃孵育得到水凝胶；f127-cs和pbs的质量体积比为0.2g∶1ml，壳寡糖和pbs的质量体积比为0.1g∶1ml，硼酸和pbs的质量体积比为0.1g∶1ml，a-ha和pbs的质量体积比为0.1g∶1ml。
69.实施例4
70.一种温度和ph双重响应的可注射自愈水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
71.1)制备f127-cs聚合物：
72.将1mmol f127溶解于100ml二氯甲烷中，加入30mol三乙胺和40mol对甲苯磺酰氯；室温反应72小时后，反应混合液经盐酸和饱和碳酸氢钠清洗，用冰乙醚沉淀，沉淀出的产物经真空干燥后得到f127-tscl；
73.取0.2mmol f127-tscl溶解于100ml二甲基甲酰胺中，随后加入3mmol cs，70℃下反应24小时，产物经8000-14000分子量透析袋纯化3天，真空冷冻干燥得到f127-cs。
74.2)制备a-ha：
75.取ha 1g溶解于100ml去离子水中，1mol(5ml)高碘酸钠水溶液缓慢加入到上述溶液中，在室温避光搅拌8小时。加入2ml乙二醇室温下淬火6h，去离子水中透析3天后，经真空冷冻干燥得到产物。
76.3)制备f127-cs/a-ha+cs+ba水凝胶：
77.在步骤1)中获得的f127-cs聚合物中加入cs、ba，用pbs配制成f127-cs聚合物及ba的混合溶液，取步骤2)中获得的a-ha加入混合溶液中，冰浴下剧烈振荡使其混匀，制得水凝胶前驱溶液，后在37℃孵育得到水凝胶；f127-cs和pbs的质量体积比为0.25g∶1ml，壳寡糖和pbs的质量体积比为0.05g∶1ml，硼酸和pbs的质量体积比为0.01g∶1ml，a-ha和pbs的质量体积比为0.01g∶1ml。
78.上述实施例1-4制备的水凝胶性能近似，下面仅以实施例1制备的水凝胶为例进行性能说明。
79.一、药物缓释实验
80.1)取去铁胺(dfo)作为药物模型进行药物缓释实验，以检测水凝胶对药物的缓释效果，通过不同ph值下的药物释放情况判断水凝胶的ph响应性。将质量体积比为1％的去铁胺添加到质量体积比为20％f127-cs的含有ba和cs混合物和质量体积比为4％氧化透明质酸中，冰浴下剧烈振荡使其混匀，后在37℃孵育得到水凝胶。
81.2)取3mm fecl3溶液，以1∶1比例同不同浓度的去铁胺溶液混合(0、2、4、6、8、10μm)，在490nm条件下测定吸光度，绘制标准曲线。
82.3)取负载去铁胺的f127-cs/a-ha+cs+ba水凝胶进行药物释放测试。将含去铁胺的f127-cs/a-ha+cs+ba水凝胶(0.2ml)浸入装有5ml pbs溶液的试管中，并在37℃下均匀摇动。在合适的时间间隔(2、4、8、12、24小时)收集1ml pbs溶液并添加新的pbs溶液补齐。使用3mm fecl3溶液与收集到的pbs溶液1∶1比例混合，在490nm测吸光度。可以看出在低ph条件下，水凝胶在8h内药物释放完全，而在ph＝7.4时24h内释放量为32％，结果整理如表1所示。
83.表1 不同条件下(ph＝5.0、ph＝7.4)负载dfo的f127-cs/a-ha+cs+ba水凝胶药物释放情况
84.85.由表1可知，当ph＝7.4时，药物释放缓慢，而当ph＝5.0时，药物释放量显著增大，证明该水凝胶具备药物缓释能力及ph响应性。
86.二、水凝胶自愈合实验
87.如图1所示，取1ml体积水凝胶两块，置于培养皿中，取其中一块水凝胶用结晶紫染色10min，后将两块水凝胶沿中部切开。将两块水凝胶相互搭接后保持不动，30min后使用镊子可将水凝胶夹起，且搭接处水凝胶相互结合，没有明显缝隙，证明水凝胶具备自愈合能力。
88.三、水凝胶体外降解实验
89.制备f127-cs/a-ha+cs+ba水凝胶，冷冻干燥称重后转移到5ml离心管中，将5ml pbs溶液添加到离心管中。在第2，4，8，12，24，48，72h，移除水凝胶，并使用冷冻干燥法将水凝胶冻干以获得干重(wd)。使用公式计算降解百分比所有实验均一式三份进行。
90.计算公式为：
91.降解率＝(wd-wi)/wi
×
100％
92.如图2a可知，未加入ba时，水凝胶6h后降解完全，加入ba后，水凝胶在72h后仍有30％左右剩余，这是由于未加入ba时，水凝胶仅通过f127的物理交联、cs与a-ha的席夫碱键作用，使得水凝胶本身的稳定性较低，处于pbs溶液中加速其降解。如图2b可知，而ba的加入，使得a-ha和ba的羟基(-oh)发生了氢键作用，降低了水凝胶的降解性，使得水凝胶能够更长时间的在pbs溶液中保留，进而能够在创面愈合过程中，能够更长时间的发挥作用，有利于糖尿病创面的愈合。
93.注：wi为初始样品干重，wd为时间t后的干重
94.四、糖尿病大鼠的创面愈合效果
95.通过对大鼠腹腔注射10mg/ml的链脲佐菌素(stz)制作糖尿病大鼠模型，成功造模后，制造直径为8mm的大鼠全层皮肤创面，取冰浴下振荡摇匀的f127-cs/a-ha+cs+ba水凝胶，通过10ml针管对创面进行注射处理，分别在3d、7d、10d、14d观察伤口愈合情况并在7d、14d取材。为确定创面修复的愈合程度和愈合进程，对创面皮肤组织形态学进行检测。取大鼠创面附近皮肤组织，以0.4％多聚甲醛固定，进行脱水处理，后进行石蜡包埋。将石蜡包埋的皮肤组织切成5μm厚的组织切片，用苏木精-伊红(he)和马森三色(mt)染色，用生物显微镜观察染色的切片。
96.如图3所示，随着愈合时间的延长，对照组和水凝胶组的创口面积均逐渐减小，但水凝胶组的创口面积小于对照组，具体数值为：通过糖尿病大鼠的创面愈合率分析，对照组在3d、7d、10d、14d的愈合率分别为14％、41％、61％、66％，而水凝胶组为20％、55％、64％、80％，说明本发明水凝胶能够促进创面愈合。之后通过he染色(图4所示)和mt染色(图5所示)结果分析，水凝胶组在各个时间段具备更好的创面修复效果，在各个时间段，创面的胶原沉积效果较对照组相比更为明显。以上结果证明，本发明制备的f127-cs/a-ha+cs+ba水凝胶具备较好的生物相容性，能够促进糖尿病创面的修复。
97.综上所述，本发明成功制备了一种温度和ph双重响应的可注射自愈水凝胶，该水凝胶可采用注射的方式置于创面上，水凝胶与创面形状相契合，可与周围组织充分接触，提高创面上水凝胶的覆盖效果；ph响应性可以动态检测创面的酸碱性，起到响应缓释药物的作用；自愈合性则能够在水凝胶断裂之后恢复，水凝胶中的壳寡糖及透明质酸具备良好的
生物相容性及生物降解性，有利于糖尿病足创面的修复。
98.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内也意图包含这些改动和变型在内。