抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体涉及抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白及其应用。

背景技术：

1、自然杀伤细胞(nk细胞)是一种天然免疫细胞，能够非常有效地破坏应激细胞，如病毒感染或肿瘤转化细胞。nk细胞具有不受mhc限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为免疫反应系统中的关键角色。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)是一种有效的细胞毒性机制，主要通过自然杀伤(nk)细胞介导。通过cd16a的adcc作用是nk细胞抗肿瘤效应的主要机制之一。当特异性抗体结合到靶向肿瘤细胞膜上以后，免疫细胞通过该反应诱导细胞死亡。

2、抗体和免疫细胞的相互作用通过fc受体(fcr)家族发生。在人类中，igg的fcr家族(fcγr)由6个受体组成：fcγri/cd64、fcγriia/cd32a、fcγriib/cd32b、fcγriic/cd32c、fcγriiia/cd16a和fcγriiib/cd16b，其中cd16a主要触发nk细胞介导的adcc。通常情况下，adcc效应主要通过结合fcγriii(cd16)的抗体激活nk细胞。人类nk细胞分为两个主要亚群：cd56 bright和cd56 dim。cd56 bright nk细胞是强有力的细胞因子产生者，但缺乏cd16a；而cd56dim具有高度的细胞毒性，表达cd16a。当通过cd16a识别igg调理的靶点时，nk细胞就会释放不同的细胞毒性分子，从而引发靶细胞的死亡。这种机制依赖于免疫突触的形成和含有穿孔素和颗粒酶的溶解颗粒的脱颗粒。除了脱颗粒外，nk细胞还可以通过将靶死亡受体(如dr4、dr5或fas)与其死亡受体配体(如fasl和trail)结合来清除靶细胞。

3、cd16a是一种跨膜受体，具有短的c-ter胞质尾，并具有两个细胞外ig样结构域。cd16a与igg的ch2以1:1的方式相互作用，其中ch2上的n297位的n-聚糖链在这种相互作用中也起着关键作用。cd16a在其细胞质尾部没有itam结构域，因此需要两条含有itam结构域的细胞内链串联的帮助，cd3ζ和fc∈riγ。cd16a结合后，属于src家族的激酶lck被激活，并磷酸化cd3ζ和/或fc∈riγ的itam结构域。磷酸化的itam允许来自syk家族的激酶招募和磷酸化，例如syk和zap-70，它们反过来负责后续的信号传导。在它们的底物中，pi3k是高度相关的，因为它将pip2转化为pip3，pip3经plc-γ处理后释放ip3和dag。dag激活pkc家族，这有助于触发脱颗粒。ip3诱导钙从内质网释放，这种钙内流是adcc触发的主要信号之一，也导致核内nfat易位，诱导其靶基因的转录。cd16a参与激活的其他途径也有助于adcc，例如erk2 mapk途径。cd16a依赖性nk细胞杀伤后，cd16a迅速下调。cd16a脱落的机制之一是由去整合素和金属蛋白酶17(adam17)介导的，后者在nk细胞上表达。adam17对cd16a的切割发生在顺式结构中，这意味着表达adam17的nk细胞不能在另一个nk细胞上诱导cd16a脱落。激活后cd16a下调的另一个机制是内化，这不仅发生在cd16a上，也发生在其他细胞内信号成分上，如cd3ζ、zap-70和syk。

4、nk细胞作为先天性免疫细胞中的杀伤细胞，可直接杀伤病原体和肿瘤细胞。与t细胞相比，nk细胞具有更强的肿瘤识别和杀伤能力，以及更强的现货型应用的潜质。如何改造治疗性抗体药物的恒定区(fc端)使其更好地激活先天免疫反应，增强抗体依赖的细胞毒作用(adcc，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，如何评估能够特异性结合cd16a的双(多)抗药效是药物研发科学家所感兴趣的问题。目前提高adcc作用的策略主要从下面几个方面：

5、(1)细胞因子：提高adcc活性的一个简单方法是用促炎细胞因子刺激nk细胞。nk细胞移植已在多个临床试验中成功进行，例如通过输注细胞因子诱导记忆样(ciml)nk细胞，最常用的细胞因子组合包括il-12、il-15和il-18。ciml nk细胞比传统nk细胞表达更多的ifn-γ，对白血病细胞和原发性急性髓系白血病(aml)母细胞显示出优越的细胞毒性。il-12会增加nk细胞产生ifn-γ和tnf-α，在一项i/ii期临床试验中，西妥昔单抗与il-12联合应用于无法切除或复发的头颈部鳞状细胞癌患者。与无进展生存期(pfs)小于100天的患者相比，pfs大于100天的患者nk细胞在体外具有更高的adcc活性。il-15是nk和cd8+t细胞生存和功能所必需的细胞因子。n-803是一种突变的n72d il-15超激动剂，在临床前模型和临床试验中显示出增强的nk细胞体外和体内活性。此外，它还增加了nk和cd8+t细胞的数量。

6、(2)抑制adam17：adam17是激活后cd16a下调的主要驱动因素。改善nk细胞adcc的一种策略是通过靶向adam17来防止cd16a脱落。研究发现，对nk细胞中使用crispr/cas9技术敲除adam17，显示出更好的ifn-γ生成和体内外adcc活性。然而，也有研究显示，阻断adam17降低了nk细胞的存活率以及cd16a介导的连环杀伤，细胞无法与靶细胞分离，阻碍其运动到另一个靶细胞。总之，adam17抑制的益处尚不清楚，结果也有争议。这一策略是否能够成功，有待于一项正在进行的临床试验(nct04023071)结果，该试验将评估携带不可切割cd16a的ipsc衍生nk细胞在aml和b细胞淋巴瘤中的应用。

7、(3)工程化抗体：抗体的fc部分进行工程化改造，可以增加fc对cd16a的亲和力，并随后改善adcc。一些突变非常流行，例如，所谓的gasdalie，由fc中的4个替换组成：g236a/s239d/a330l/i332e。该突变显示对cd16a的亲和力显著增加，而cd32b亲和力几乎没有增加。另一个突变称为突变体18(f243l/r292p/y300l/v305i/p396l)，adcc显著增加。这些突变现已作为抗her2抗体margetuximab进入临床，并在i期治疗各种her2阳性癌时显示出良好的效果。此外，抗体fc n-聚糖的糖工程化有望增加对cd16a的亲和力。研究最多的糖修饰是去糖基化，例如去岩藻糖修饰。这种修饰导致与cd16a的结合增加，adcc改善。这项技术已被用于抗cd20抗体obinutuzumab。

8、(4)nk细胞接合器：除了工程化抗体之外，还可以研究抗体的形式。基于双特异性t细胞接合器(bite)策略的成功，为nk细胞开发了一种类似的形式，即所谓的双特异性杀伤细胞接合器(bike)。bike由两个scfv通过连接序列组成，一个单链抗体靶向cd16a，另一个靶向肿瘤抗原。此外，还有三特异性杀伤细胞接合器(trike)，有2种肿瘤抗原与cd16a一起被靶向，或者添加il-15代替第三种单链抗体。这种结构的使用允许nk细胞重新定位到肿瘤细胞，并导致针对靶细胞的强大adcc作用。afm13是一种针对cd16a和cd30的双特异性抗体，目前处于临床ⅱ期，用于治疗外周t细胞淋巴瘤、转化型蕈样变性和霍奇金淋巴瘤。在一项治疗复发或难治性霍奇金淋巴瘤的ib临床研究中，afm13与pembrolizumab的联合治疗产生了88％的客观反应率，总反应率为83％。gtb-3550是一种cd16/cd33/il-15的trike形式，目前正在进行多种类型白血病的i/ii期试验研究(nct03214666)。

9、然而，在大多数肿瘤中包括肠癌，肾癌，肝癌，乳腺癌和肺癌发现其肿瘤微环境中nk细胞的数目极少。因此，业内发展一种利用cd16a的活性来治疗癌症的免疫治疗方法，如具有肿瘤表面抗原特异性的抗体以及nk细胞cd16a特异性的抗体形成的双特异性分子，目前已经开发了her2/neu和cd16a的双特异性抗体，比单独的her2抗体具有更强的抗肿瘤活性；afm13，一种特异性结合cd16a和cd30的双特异性抗体，通过结合nk细胞或单核细胞表面的cd16分子，使这些免疫效应细胞靶向表达cd30的肿瘤细胞进行杀伤，该抗体在霍奇金氏瘤的小鼠模型中还是患者中都表现出清除肿瘤的效果。但是传统的cd16a抗体或者抗cd16a抗原结合蛋白暴露一段时间会导致nk细胞衰竭或者nk细胞毒性效力减低，进而影响nk细胞的肿瘤杀伤作用。导致cd16a双抗不能长期给药，影响其效果。

10、白细胞介素-15(interleukin-15，il-15)是一种长14–15kda的细胞因子，对于nk细胞、nkt细胞和memory cd8+t细胞功能非常重要。il-15通过与其受体il-15rα结合产生具有极高生物效价的复合物il-15超激动剂(il-15sa)后一起被转导转运至靶细胞。il-15sa强烈激活响应表达il-15r的细胞，特别是nk细胞/t细胞，从而促进抗肿瘤和抗病毒功能。il-15具有广泛的免疫调节作用，能够参与调节t细胞，特别是nk细胞、记忆性cd8+t细胞的存活、增殖与功能。il-15与il-2结构十分相似，同属于螺旋型细胞因子家族。il-15的异三聚体受体与il-2受体共用il-2r/il-15rβ(cd122)和共同γc链(cd 132)，由于这些共同的受体成分和共用jak 1/jak 3/stat 5信号通路，il-15与il-2具有相同的功能，包括刺激t细胞增殖、产生细胞毒性t淋巴细胞、刺激b细胞合成免疫球蛋白以及nk细胞的产生和持续存活。在许多适应性免疫应答中，il-2和il-15具有独特且常为竞争性的作用。主要有以下四点：1、il-2可以调节tregs细胞的激活，而il-15则不能调节。2、il-2可以通过激活诱导的cd8+效应t细胞的细胞死亡从而抑制t细胞反应。3、il-15对nk、效应细胞cd8+和记忆表型cd8+t细胞的分化起着必不可少的作用。4、临床前研究标明，il-15与il-2的毒性不同，与il-2相比，il-15几乎观察不到血管毛细血管渗漏。这些因素使得il-15成为肿瘤免疫策略中更具潜力的细胞因子。目前有多个il-15靶点产品仍处于临床试验阶段，其中最值得关注的是il-15超级激动剂n-803，为il-15蛋白n72d突变后结合il-15ra及igg1fc共同表达的融合蛋白，2022年5月23日，immunitybio向fda递交il-15超级激动剂n-803的上市申请，用于与卡介苗(bcg)联合治疗卡介苗不响应的非肌肉浸润性膀胱癌(nmibc)。2021年公布的临床数据，n-803+bcg联合治疗效果显著，cr率达到71％(59/83)，平均cr维持时间为24.1个月。一项1期临床实验显示，nivolumab(pd-1抗体，opdivo)联合n-803治疗转移性非小细胞肺癌的能够明显延长患者长期生存。基因泰克与xencor公司合作开发il-15细胞因子目前正在进行联用tecentriq临床研究。恒瑞医药的shr-1501(il-15融合蛋白)于2019年5月14日获批开展shr-1501临床试验。此外，shr-1316(pd-l1单抗药物)将联合shr-1501用于治疗失败的晚期恶性肿瘤患者。然而，细胞因子在临床上的使用存在着单药给药靶向性差的缺点，只有高浓度给药才可以达到抗肿瘤作用，而高浓度给药会产生免疫抑制作用和高毒性。并且，非靶向性细胞因子对于免疫系统的激活是系统性的，免疫系统被广泛的激活，具有致命的副作用。此外，由于细胞因子属于小分子量蛋白，不具备抗体的体内循环保护机制，单纯的细胞因子往往半衰期较短，需要短时间重复高剂量给药。目前临床研究药物多采用peg化或者fc融合来提高细胞因子的半衰期，虽然半衰期得以延长，但仍无法解决细胞因子的靶向性差的问题。

技术实现思路

1、本发明的第一目的是提供一种新型的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白。

2、本发明提供的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白包括：特异性结合cd16a的cd16a结合区、特异性结合肿瘤相关抗原(taa)的taa结合区、il-15和il-15rα结合形成的il-15/il-15rα复合物、以及fc结构域。所述抗原包括肿瘤相关抗原(taa)。本发明提供的三功能融合蛋白不仅同时靶向cd16a和taa，还融合了il-15/il-15rα复合物以及fc结构域，其具有独特的组分并形成了独特的构型。此外，本发明的三功能融合蛋白利用il-15及il-15rα分别替代双特异抗体的其中一个抗体结构中的cl及ch1结构域，通过il-15与il-15rα之间的超高的亲和力(kd约30-100pm)形成的il-15/il-15rα结构，确保双特异抗体轻重链之间正确配对，进而解决双特异抗体轻链错配问题。同时，三功能融合蛋白cd16a抗体靶向nk细胞到肿瘤部位，并在肿瘤细胞附近激活nk细胞。传统的cd16a抗体或者抗cd16a抗原结合蛋白暴露一段时间会导致nk细胞衰竭或者nk细胞毒性效力减低，导致cd16a抗体不能长期给药，影响肿瘤治疗效果，但受损的nk细胞毒性可以通过本发明三功能融合蛋白结构当中的细胞因子il-15和il-15rα刺激而恢复，进而增强nk细胞的肿瘤细胞杀伤作用，解决了cd16a抗体导致的nk细胞耗竭和肿瘤细胞毒性减弱问题。il-15和il-15rα刺激nk细胞和t细胞等免疫效应细胞的增殖和激活，大大增强机体对肿瘤的免疫抑制活性。

3、可选的，所述cd16a结合区包括抗cd16a抗体或其抗原结合片段，优选的，所述cd16a结合区为靶向cd16a的fab片段或fv片段。

4、可选的，所述taa结合区包括抗taa抗体或其抗原结合片段，优选的，所述taa结合区为靶向taa的fab片段或fv片段。

5、可选的，所述的融合蛋白还包括连接片段；所述连接片段的氨基酸序列优选为若干个gs重复序列。

6、可选的，所述融合蛋白包含若干条肽链，所述il-15和所述il-15rα分别位于不同肽链上。

7、可选的，所述三功能融合蛋白包括：1个所述的taa结合区。

8、可选的，所述的融合蛋白包括：第一单体和第二单体；其中，所述第一单体包括：所述的taa结合区和第一fc链；所述第二单体包括：所述的cd16a结合区、所述的il-15/il-15rα复合物和第二fc链；所述taa结合区为靶向taa的fab片段；所述cd16a结合区为靶向cd16a的fv片段；或者，所述第一单体包括：所述的cd16a结合区和第一fc链；所述第二单体包括：所述的taa结合区、所述的il-15/il-15rα复合物和第二fc链；所述cd16a结合区为靶向cd16a的fab片段；所述taa结合区为靶向taa的fv片段；并且，所述第一fc链和所述第二fc链聚合形成所述的fc结构域。

9、可选的，所述第一单体包括第一肽链和第二肽链，所述第二单体包括第三肽链和第四肽链；所述第一肽链包括：taa结合抗体可变区、抗体恒定区；所述第二肽链包括：taa结合抗体可变区、抗体恒定区；所述第二肽链的抗体恒定区包括第一fc链；所述第三肽链包括：cd16a结合抗体可变区、细胞因子和第二fc链；所述第四肽链包括：cd16a结合抗体可变区、细胞因子；所述第一肽链的taa结合抗体可变区、抗体恒定区，以及所述第二肽链的taa结合抗体可变区、抗体恒定区的配对区域形成所述的靶向taa的fab片段；所述第三肽链的cd16a结合抗体可变区和所述第四肽链的cd16a结合抗体可变区配对形成所述的靶向cd16a的fv片段；所述第三肽链的细胞因子和所述第四肽链的细胞因子结合形成所述的il-15/il-15rα复合物。

10、可选的，所述第一单体包括第一肽链和第二肽链，所述第二单体包括第三肽链和第四肽链；所述第一肽链包括：cd16a结合抗体可变区、抗体恒定区；所述第二肽链包括：cd16a结合抗体可变区、抗体恒定区；所述第二肽链的抗体恒定区包括第一fc链；所述第三肽链包括：taa结合抗体可变区、细胞因子和第二fc链；所述第四肽链包括：taa结合抗体可变区、细胞因子；所述第一肽链的cd16a结合抗体可变区、抗体恒定区，以及所述第二肽链的cd16a结合抗体可变区、抗体恒定区的配对区域形成所述的靶向cd16a的fab片段；所述第三肽链的taa结合抗体可变区和所述第四肽链的taa结合抗体可变区配对形成所述的靶向taa的fv片段；所述第三肽链的细胞因子和所述第四肽链的细胞因子结合形成所述的il-15/il-15rα复合物。

11、可选的，自肽链的n端到c端，所述第三肽链的融合顺序为：抗体可变区～细胞因子～第二fc链，或为：细胞因子～抗体可变区～第二fc链；自肽链的n端到c端，所述第四肽链的融合顺序为：抗体可变区～细胞因子；或为：细胞因子～抗体可变区；“～”表示连接片段；所述抗体可变区为cd16a结合抗体可变区或taa结合抗体可变区。

12、可选的，所述三功能融合蛋白包括：2个所述的taa结合区。

13、可选的，所述的融合蛋白包括：第一单体和第二单体；2个所述的taa结合区分别为第一taa结合区和第二taa结合区；其中，所述第一单体包括：所述的第一taa结合区和第一fc链；所述第二单体包括：所述的cd16a结合区、所述的第二taa结合区、所述的il-15/il-15rα复合物和第二fc链；所述第一taa结合区为靶向taa的fab片段；所述cd16a结合区为靶向cd16a的fv片段；所述的第二taa结合区为靶向taa的fv片段；或者，所述第一单体包括：所述第一taa结合区、所述的cd16a结合区和第一fc链；所述第二单体包括：所述的第二taa结合区、所述的il-15/il-15rα复合物和第二fc链；所述cd16a结合区为靶向cd16a的fv片段；所述第一taa结合区和所述所述第二taa结合区均为靶向taa的fv片段；并且，所述第一fc链和所述第二fc链聚合形成所述的fc结构域。

14、可选的，所述第一单体包括第一肽链和第二肽链，所述第二单体包括第三肽链和第四肽链；所述第一肽链包括：taa结合抗体可变区、抗体恒定区；所述第二肽链包括：taa结合抗体可变区、抗体恒定区；所述第二肽链的抗体恒定区包括第一fc链；所述第三肽链包括：taa结合抗体可变区、cd16a结合抗体可变区、细胞因子和第二fc链；所述第四肽链包括：taa结合抗体可变区、cd16a结合抗体可变区、细胞因子；所述第一肽链的taa结合抗体可变区、抗体恒定区，以及所述第二肽链的taa结合抗体可变区、抗体恒定区的配对区域形成所述的第一taa结合区，所述的第一taa结合区为靶向taa的fab片段；所述第三肽链的taa结合抗体可变区和所述第四肽链的taa结合抗体可变区配对形成所述的第二taa结合区，所述的第二taa结合区为靶向taa的fv片段；所述第三肽链的cd16a结合抗体可变区和所述第四肽链的cd16a结合抗体可变区配对形成所述的cd16a结合区，所述cd16a结合区为靶向cd16a的fv片段；所述第三肽链的细胞因子和所述第四肽链的细胞因子结合形成所述的il-15/il-15rα复合物。

15、可选的，自肽链的n端到c端，所述第三肽链或所述第四肽链的氨基酸片段的融合顺序包括以下任意一种，其中“～”表示连接片段：

16、(1)taa结合抗体可变区～cd16a结合抗体可变区～细胞因子；

17、(2)taa结合抗体可变区～细胞因子～cd16a结合抗体可变区；

18、(3)cd16a结合抗体可变区～taa结合抗体可变区～细胞因子；

19、(4)cd16a结合抗体可变区～细胞因子～taa结合抗体可变区；

20、(5)细胞因子～taa结合抗体可变区～cd16a结合抗体可变区；

21、(6)细胞因子～cd16a结合抗体可变区～taa结合抗体可变区。

22、可选的，所述的融合蛋白包括：第一单体和第二单体；其中，所述第一肽链包括：taa结合抗体可变区、cd16a结合抗体可变区和抗体恒定区；所述第二肽链包括：taa结合抗体可变区、cd16a结合抗体可变区、抗体恒定区；所述第二肽链的抗体恒定区包括第一fc链；所述第三肽链包括：taa结合抗体可变区、细胞因子和第二fc链；所述第四肽链包括：taa结合抗体可变区、细胞因子；所述第一肽链的taa结合抗体可变区和所述第二肽链的taa结合抗体可变区配对形成所述的第一taa结合区，所述的第一taa结合区为靶向taa的fv片段；所述第一肽链的cd16a结合抗体可变区和所述第二肽链的cd16a结合抗体可变区配对形成所述的cd16a结合区，所述cd16a结合区为靶向cd16a的fv片段；所述第三肽链的taa结合抗体可变区和所述第四肽链的taa结合抗体可变区配对形成所述的第二taa结合区，所述的第二taa结合区为靶向taa的fv片段；所述第三肽链的细胞因子和所述第四肽链的细胞因子结合形成所述的il-15/il-15rα复合物。

23、可选的，在所述第一肽链或所述第二肽链中，自肽链的n端到c端，所述taa结合抗体可变区和所述cd16a结合抗体可变区的融合顺序为：taa结合抗体可变区～cd16a结合抗体可变区，或cd16a结合抗体可变区～taa结合抗体可变区；“～”表示连接片段；或者，在所述第三肽链或所述第四肽链中，自肽链的n端到c端，所述taa结合抗体可变区和所述细胞因子的融合顺序为：taa结合抗体可变区～细胞因子，或细胞因子～taa结合抗体可变区。

24、可选的，所述taa结合抗体可变区选自靶向taa的vh结构域或vl结构域，所述cd16a结合抗体可变区选自靶向cd16a的vh结构域或vl结构域，所述的细胞因子选自il-15或il-15rα；所述的抗体恒定区包括cl结构域或ch1结构域。

25、可选的，所述的vh结构域和vl结构域之间具有一对或多对二硫键，并且包含以下突变组合形式的任意一种以上，根据eu计数：

26、

27、可选的，所述il-15包括：il-15及其能结合il-15ra的突变，截短及各种衍生物；所述il-15ra包括：il-15ra及其能结合il-15的突变，截短及各种衍生物；优选地，所述il-15包括但不限于以下任意一组合所示的突变方式，计数方式根据il-15的氨基酸序列的第一个氨基酸开始算为第1位；

28、 组合 il-15突变 1 n1d 2 n4d 3 d8n 4 d30n 5 d61n 6 e64q 7 n65d 8 q108e 9 n1d/d61n 10 n1d/e64q 11 n4d/d61n 12 n4d/e64q 13 d8n/d61n 14 d8n/e64q 15 d61n/e64q 16 e64q/q108e 17 n1d/n4d/d8n 18 d61n/e64q/n65d 19 n1d/d61n/e64q/q108e 20 n4d/d61n/e64q/q108e 21 d30n/e64q/n65d

29、；

30、或者，所述il-15/il-15ra复合物包括但不限于以下任意一组合所示的突变方式，计数方式根据il-15或il-15ra的氨基酸序列的第一个氨基酸开始算为第1位；

31、 组合 il15 il15ra 1 wt d96 2 wt d96/p97 3 wt d96/p97/a98 4 e87c d96/c97 5 e87c d96/p97/c98 6 e87c d96/c97/a98 7 v49c s40c 8 l52c s40c 9 e89c k34c 10 q48c g38c 11 e53c l42c 12 c42s a37c 13 l45c g38c 14 l45c a37c

32、。

33、可选的，所述taa选自cd20、cd19、cd30、cd33、cd38、cd40、cd52、slamf7、gd2、cd24、cd47、cd133、cd217、cd239、cd274、cd276、cea、epcam、trop2、tag72、muc1、muc16、mesothelin、folr1、cldn18.2、egfr、egfr viii、c-met、her2、fgfr2、fgfr3、psma、psca、epha2、adam17、17-a1、nkg2d ligands、mcsp、lgr5、ssea3、slc34a2、bcma、gpnmb、ccr4、vegfr-2、cd6、整合素α4、pdgfrα、neugcgm3、整合素αvβ3、cd51、ctaa16.88、cd22、ror1、cspg4、ss1或igfr1。

34、可选的，所述fc结构域选自human igg1 fc、human igg2 fc、human igg3 fc、human igg4 fc或其变异体，优选自igg1 fc、或human igg4 fc或其变异体；所述fc结构域为fc异源二聚体形式；优选地，所述fc异源二聚体包含但不限于以下突变的组合，以下突变为根据eu计数：

35、

36、可选的，所述fc结构域选择消除免疫效应功能，优选包含以下任一突变方式，以下突变为根据eu计数：

37、

38、可选的，所述第一fc链不结合protein a，优选包括突变h435r或h435r/y436f，根据eu计数；所述第二fc链能够结合protein a。

39、可选的，所述cd16a结合区包括序列如seq id no:97所示的vh结构域和seq idno:96所示的vl结构域；或者，所述il-15的序列如seq id no:104或105所示；或者，所述il-15ra的序列如seq id no:106至112中任意一项所示；优选的，所述cd16a结合区的vh和vl之间，和/或所述il-15与il-15ra之间，至少具有一对以上二硫键。

40、可选的，由以下任意一组序列所示或与其具有90％以上同一性的氨基酸片段融合得到：

41、(1)seq id no:01、02、03、04；

42、(2)seq id no:01、05、03、06；

43、(3)seq id no:07、08、09、10；

44、(4)seq id no:01、02、11、12；

45、(5)seq id no:01、02、13、14；

46、(6)seq id no:01、05、11、15；

47、(7)seq id no:01、05、13、16；

48、(8)seq id no:38、39、40、41；

49、(9)seq id no:38、39、42、43；

50、(10)seq id no:38、39、44、45；

51、(11)seq id no:38、39、46、47；

52、(12)seq id no:48、49、50、51；

53、(13)seq id no:48、49、52、53；

54、(14)seq id no:48、49、54、55；

55、(15)seq id no:48、49、56、57；

56、(16)seq id no:58、59、60、61；

57、(17)seq id no:58、59、62、63；

58、(18)seq id no:58、59、64、65；

59、(19)seq id no:58、59、66、67；

60、(20)seq id no:68、69、70、71；

61、(21)seq id no:72、73、70、71；

62、(22)seq id no:74、75、70、71；

63、(23)seq id no:76、77、70、71；

64、(24)seq id no:78、79、70、71；

65、(25)seq id no:38、39、80、81；

66、(26)seq id no:38、39、82、83；

67、(27)seq id no:38、39、84、85；

68、(28)seq id no:38、39、86、87；

69、(29)seq id no:38、39、88、89；

70、(30)seq id no:38、39、90、91；

71、(31)seq id no:38、39、92、93；

72、(32)seq id no:38、39、94、95。

73、可选的，所述抗原还包括：传染性疾病相关抗原、病原体、免疫功能相关抗原。针对taa以外的抗原时，将三功能融合蛋白中的特异性结合肿瘤相关抗原(taa)的taa结合区替换为相应的抗原结合区。

74、本发明还提供一种核酸分子，其编码所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白。

75、本发明还提供一种药物组合物，其含有所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，以及药学上可接受的载体。

76、本发明还提供所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白在制备用于抑制或治疗癌症、感染和免疫调节疾病的药物中的应用。

77、所述癌症包括前列腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、肾癌、口腔癌、咽癌、胰腺癌、子宫癌、甲状腺癌、皮肤癌、头颈癌、宫颈癌、卵巢癌或血液系统癌症。

78、本发明还提供一种蛋白的复合单元，所述复合单元包括：所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白中的第三肽链的cd16a结合抗体可变区和细胞因子、第四肽链的cd16a结合抗体可变区和细胞因子，以及若干连接片段；所述第三肽链的cd16a结合抗体可变区通过连接片段与所述第三肽链的细胞因子融合；所述第四肽链的cd16a结合抗体可变区通过连接片段与所述第四肽链的细胞因子融合；所述第三肽链的cd16a结合抗体可变区和所述第四肽链的cd16a结合抗体可变区选自靶向cd16a的vh结构域或vl结构域，并配对形成fv片段；所述第三肽链的细胞因子和所述第四肽链的细胞因子选自il15或il15rα，并结合形成il-15/il-15r复合物；优选的，所述vh结构域和vl结构域之间，和/或所述il15和il15rα之间，具有一对以上的二硫键。

79、本发明还提供一种核酸分子，其编码所述的蛋白的复合单元。

80、发明的有益效果：

81、(1)本发明提供的三功能融合蛋白包括特异性结合cd16a的cd16a结合区、特异性结合肿瘤相关抗原(taa)的taa结合区、il-15和il-15rα结合形成的il-15/il-15rα复合物、以及fc结构域，不仅能够同时靶向cd16a和taa，还融合了il-15/il-15rα复合物以及fc结构域，其具有独特的组分并形成了独特的构型。

82、(2)本发明设计的taa/cd16a/il15三功能融合蛋白通过同时结合肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原(taa)和nk细胞上的cd16a，将nk细胞靶向肿瘤，nk细胞释放穿孔素、颗粒酶，引发细胞凋亡并导致肿瘤细胞死亡。细胞因子il15扩增并维持nk细胞功能，刺激免疫细胞增殖，改变肿瘤的免疫微环境。

83、(3)本发明构建的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，具有il-15/il-15rα活性，能够将细胞因子靶向到肿瘤部位，可以特异的在肿瘤部位扩增和活化免疫效应细胞(nk细胞及t细胞)，使免疫细胞数目以及杀伤性细胞因子的释放增加，更加有效地激活免疫反应杀伤肿瘤细胞。

84、(4)将il-15和il-15rα替换抗体结构中的cl和ch1结构域，利用il-15和il-15rα的高亲和力形成il-15/il-15rα复合物，从而实现双特异抗体轻链的正确配对，解决双特异性抗体轻链错配问题。另外，可通过氨基酸序列突变，在vh和vl之间，以及il-15和il-15rα之间添加一对或多对二硫键，进一步地增强轻链/重链间的结合活性，结合fc异源二聚体技术解决双特抗体重链错配问题，更有效克服双特异性抗体制备过程中轻链、重链错配、副产物高、稳定性差等挑战，制备得到正确配对的多功能融合蛋白，同时，缩短多功能融合蛋白开发周期，降低生产成本。

85、(5)可保留fc结构域的效应功能，或采用消除免疫效应形式的fc结构域。采用消除免疫效应形式的fc结构域使fc不能结合fcrγiii(cd16a)。本发明的融合蛋白若保留fc结构域的效应功能，也观察到免疫细胞相对应的激活效果。