一种棘孢木霉菌及其应用

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一种棘孢木霉菌及其应用。


背景技术：

2.铁皮石斛(dendrobium officinale kimura et migo)是我国传统中药材，目前主要以人工栽培为主，但病害频发，严重影响铁皮石斛的产量和药用价值。由棒状新拟盘多毛孢 (neopestalotiopsis clavispora)引起的铁皮石斛叶片黑斑病，是近年来浙江省雁荡山铁皮石斛种植区发现的一种新型真菌性病害，具有发病率高、病害范围广、危害性强等特点。目前，生产上对于铁皮石斛黑斑病的防治仍以化学农药防治为主，但化学药剂的长期使用会引起农药残留、影响食品药品安全、破坏生态平衡、产生耐药性等一系列问题。生防菌制剂不仅具有抗病促生长，长效无污染的特点，且适用于工业化、规模化生产。合理利用生防微生物资源，提高铁皮石斛的抗病能力，可以在一定程度上减少化学农药的施用量，这也符合农业的可持续发展。因此，生防菌剂相关研究已成为铁皮石斛产业的一个重要方向。
3.目前未发现棘孢木霉在铁皮石斛抗病促生上的应用。近年来，黑斑病是铁皮石斛的主要病害，生产实践中普遍以化学药剂为主，有研究表明，30％吡唑醚菌酯悬浮剂1000倍稀释液对黑斑病防治效果最优。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了提供一种在提高铁皮石斛抗叶片黑斑病能力和促进生长的微生物制剂。
5.本发明提供一种棘孢木霉菌(trichoderma asperellum)，所述棘孢木霉菌的菌株号为 wzu-do1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.3.20831，保藏日期为2022年8月10日。
6.本发明提供一种含上述的棘孢木霉菌的微生物制剂。
7.本发明提供一种上述的棘孢木霉菌或上述的微生物制剂在抑制铁皮石斛黑斑病病原菌中的应用。
8.进一步地限定，棘孢木霉菌的有效的浓度为1
×
107cfu/ml。
9.本发明提供一种上述的棘孢木霉菌或上述的微生物制剂在促进铁皮石斛生长中的应用。
10.进一步地限定，棘孢木霉菌的有效的浓度为1
×
107cfu/ml。
11.进一步地限定，述生长为根长、株高、鲜重和干重。
12.一种铁皮石斛黑斑病的防治方法，所述方法利用上述的微生物制剂喷洒在铁皮石斛的叶片上。
13.进一步地限定，铁皮石斛黑斑病的防治的环境为28℃条件下12h光照、12h黑暗和ph＝7。
14.本发明提供一种促进铁皮石斛生长的方法，所述方法是上述的微生物制培养铁皮
石斛幼苗。
15.有益效果：(1)棘孢木霉菌(trichoderma asperellum)wzu-do1对铁皮石斛抗病作用效果较为显著，同时还显著促进铁皮石斛生长，对减少化学农药的使用有一定作用，也是保证食用安全的重要手段。稻秸、麦麸和蚯蚓粪都是农业上的废弃物，废物再利用对环保具有较好意义，同时可以为微生物提供良好的碳源和氮源，富含大量微量元素，作为基质同时也是一种天然有机肥料。
16.(2)棘孢木霉菌(trichoderma asperellum)wzu-do1培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。菌株wzu-do1接种后铁皮石斛黑斑病发病率为 8％，生防效果与化学药剂类似，且不会产生化学药剂带来的耐药性和环境污染问题。
17.【生物保藏】木霉(trichoderma sp.)，菌株号为wzu-do1，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.3.20831，保藏日期为2022年8月10日。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
18.图1为菌株wzu-do1在马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基上的菌落形态。
19.图2为菌株wzu-do1在光学显微镜下的菌丝和孢子形态。
20.图3为菌株wzu-do1对铁皮石斛促生作用效果。
21.图4为菌株wzu-do1对铁皮石斛黑斑病发病株抗病作用效果。
具体实施方式
22.实施例1.菌种分离、鉴定和保藏
23.1.分离出棘孢木霉菌的方法：菌株wzu-do1是2021年8月在浙江省温州市乐清铁皮石斛种植区内生长状况较好的植株上分离获得的，该菌株能明显改善铁皮石斛的抗病能力，同时对铁皮石斛促生作用显著。
24.2.鉴定：子囊菌门棘孢木霉菌(trichoderma asperellum)wzu-do1的菌落特征如下：形态学特征观察表明：在pda平板上培养2-3天后，首先产生絮状、白色的菌丝，长势迅速，后菌丝上逐渐产生深绿色孢子(图1)。光学显微镜下观察，分生孢子成簇状，圆形或卵圆形，大小2-4μm(n＝50)，分生孢子梗对生，主分枝呈树状分布，侧枝分散伸展，中间膨大凸起，呈安瓿瓶状(图2)。扩增its区序列并进行测序，pcr扩增得到的its全序列如
25.(its:gtgaacgtttaccaaacttgttgcctccggcggggtccacgccccgggtgcgtc gcagccccggaaccaggcgcccgccggaggaaccaaccaaactctttctgtagtcccctcgcggacgtatttcttacagctctgagcaaaaattcaaaatgaatcaaaactttcaac aacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattct ggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccgggggatcggcgttggggatcgggacccctcacacgggtgccggccccgaaatacagtggcggtctcgcc gcagcctctcctgcgcagtagtttgcacaactcgcaccgggagcgcggcgcgtccacgtccgtaaaacacccaactttctgaaatg)seq id no:1所示，菌株wzu-do1的its序列在genbank的登录号为ol677268。
26.利用引物序列its1:tccgtaggtgaacctgcgg(seq id no:2所示)、its4: tcctccgcttattgatatgc(seq id no:3所示)，与棘孢木霉的相似度为99％。
27.实施例2.微生物菌剂的制备
28.以稻秸、麦麸和蚯蚓粪(质量比1：1：1)为培养基质，制备成固体培养基质装入高压灭菌袋内，于121℃和101.3千帕的高压条件下灭菌30分钟。待培养基质冷却后，在无菌条件下接种棘孢木霉菌wzu-do1，然后进行人工培养。具体培养条件为28℃、12h光照+12h 黑暗、ph7，培养10-15天(期间不断翻动)。制备的固体菌剂中，棘孢木霉wzu-do1活菌数为1
×
109cfu/g。
29.实施例3.棘孢木霉菌在促进铁皮石斛生长的应用
30.棘孢木霉菌(trichoderma asperellum)wzu-do1对铁皮石斛的促生能力作用效果分析。
31.棘孢木霉菌wzu-do1可产生植物生长刺激物质吲哚乙酸。产吲哚乙酸能力：向菌种斜面上加入10ml无菌水，用已灭菌的接种环刮下孢子制成孢子悬液，使其浓度为1
×
107cfu/ml。然后取2ml孢子悬液接种于种子培养摇瓶中，种子摇瓶装液量为25ml/250ml，置于200rpm旋转式摇床，30℃培养2天。将种子液按6％(v/v)接种量接种于发酵培养基， 30℃，200rpm培养5天。离心去除菌体﹐上清液用等体积乙酸乙酯萃取两遍，浓缩得到棘孢木霉菌wzu-do1的次级代谢产物。采用hplc法测定吲哚乙酸含量，结果表明菌株能产生吲哚乙酸，通过内标法得出棘孢木霉菌wzu-do1吲哚乙酸的产量为3.5mg/l，高于已报道的具有促生长的棘孢木霉菌。
32.以稻秸、麦麸和蚯蚓粪为培养基质，制备成固体培养基质装入高压灭菌袋内，于121℃和101.3千帕的高压条件下灭菌30分钟。待培养基质冷却后，在无菌条件下接种棘孢木霉菌 (trichoderma asperellum)wzu-do1，然后进行人工培养。具体培养条件为28℃、12h光照+12h黑暗、ph7，培养10-15天(期间不断翻动)。将培养好的菌剂(实施例2获得的固体菌剂)置于铁皮石斛幼苗栽培基质表面，每丛铁皮石斛幼苗的固体菌剂接种量为5g，施用菌剂后，基质相对含水量维持在60％以上5天，以确保菌丝在基质内成活。将苗龄为6个月幼苗移栽至处理好的基质中，移栽30天后测定施用菌剂组和未施用菌剂组的生长指标。菌剂处理组和未处理的对照组各为50株，并设3组重复。结果如图3和表1。
33.表1菌株wzu-do1促进铁皮石斛生长结果
[0034][0035]
实施例4.棘孢木霉菌在预防黑斑病病原菌的应用
[0036]
棘孢木霉菌(trichoderma asperellum)wzu-do1对铁皮石斛的抗病能力作用效果分析。
[0037]
以稻秸、麦麸和蚯蚓粪为培养基质，制备成固体培养基质装入高压灭菌袋内，于121℃和101.3千帕的高压条件下灭菌30分钟。待培养基质冷却后，在无菌条件下接种棘孢木霉菌 (trichoderma asperellum)wzu-do1，然后进行人工培养。具体培养条件为28℃、
12h光照+12h黑暗、ph7，培养10-15天(期间不断翻动)。将培养好的菌剂置于铁皮石斛幼苗栽培基质表面，每丛铁皮石斛幼苗的固体菌剂接种量为5g，施用菌剂后，基质相对含水量维持在60％以上5天，以确保菌丝在基质内成活。
[0038]
通过在pda培养基上25℃黑暗培养7天的黑斑病病原菌(记载在occurrence ofneopestalotiopsis clavispora causing leaf spot on dendrobium officinale in china，peng cao, yuhui fang,zikui zheng,xia han,huixi zou,and xiufeng yan)，制得病菌孢子悬浮液,将其稀释到2
×
104cfu/ml。
[0039]
将苗龄为12个月幼苗移栽至处理好的基质中，均选取供试植株上部第三片叶，用针刺法人工制造伤口，每个伤口注射0.5ml病原菌孢子悬浮液，温室内温度为20-25℃，湿度60％，每种处理均为50株，并设3组重复。接种后每天监控黑斑病的发病程度，统计发病率、病情指数。
[0040]
病叶分级标准：病情分级主要根据接种叶片出现病斑数量及直径，初定分级标准为：0：正常；1：叶片有少量病斑；2：叶片有病斑,发病面积占叶片总面积1/4以下；3：叶片有病斑,发病面积占叶片总面积的1/4-1/2；4：叶片有病斑,发病面积占叶片总面积1/2-3/4；5：叶片有病斑,发病面积占叶片总面积3/4以上。
[0041]
发病率＝(感病叶数/接种叶数)
×
100％；
[0042]
病情指数＝σ(各级病叶数
×
该级代表数值)
×
100％/(总叶数
×
最高一级代表数值)。
[0043]
结果见图4，棘孢木霉菌(trichoderma asperellum)wzu-do1菌剂显著降低铁皮石斛黑斑病发病率和病情指数，接种后第30天防治效果35％。此外，我们还使用了市面常用的黑斑病防治剂30％吡唑醚菌酯进行试验，接种后第30天，防病效果在24％，显著低于 wzu-do1处理组。
[0044]
实施例5.棘孢木霉菌在治疗黑斑病病原菌的应用
[0045]
2021年8月，在中国浙江省温州乐清的铁皮石斛栽培基地中，观察到温室栽培铁皮石斛上感染了一种严重的新型黑斑病。园区中超过20％的铁皮石斛植株表现出典型的黑斑病发病症状。该症状初期表现为叶片出现小的、圆形黑斑。随着病情的发展，病变组织中心凹陷，边缘呈黑色。发病后分别喷施市面上常用的抗叶斑病农药30％吡唑醚菌酯悬浮剂1000倍稀释液和wzu-do1孢子悬浮液(有效浓度为1
×
107cfu/ml)。
[0046]
结果表明，使用30％吡唑醚菌酯悬浮剂1000倍稀释液，抗病效果为30％，抗病效果一般。而喷施wzu-do1孢子悬浮液(有效浓度为1
×
107cfu/ml)后，抗病效果达到75％。