一种抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药，具体涉及一种抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用。

背景技术：

1、现如今，随着抗生素的过度使用，细菌抗生素耐药性(antimicrobialresistance)已成为全球健康及食品安全所面临的最大威胁之一。对于由革兰氏阴性菌如碳青霉烯类耐药大肠杆菌等引起的一系列疾病，主要依赖于粘菌素和替加环素加以治疗，但由于因质粒介导的粘菌素耐药基因(mcr)在全球范围内广泛传播，粘菌素的临床作用大大削弱，因此，替加环素成为了临床治疗抗生素感染的“最后一道防线”之一。

2、四环素及其衍生物(例如替加环素)是治疗革兰氏阴性细菌感染的一大临床选择，被加以广泛运用。破坏四环素类抗生素的可转移tet(x)酶的出现，对抗菌治疗和食品/环境安全构成了巨大挑战。不同于先前广泛研究的替加环素耐药的外排泵机制，由tet(x)基因编码的黄素依赖性单加氧酶，以替加环素作为底物，对其起着一定的修饰作用，使替加环素失去活力。其中，从肠杆菌科和不动杆菌中分离出的可转移替加环素耐药基因tet(x4)基因极为重要。了解其特性和耐药机制，可为医疗及卫生行业提供重要依据。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的缺陷，本技术提供了一种可以特异性结合可转移替加环素耐药蛋白(简称tet(x4))，有望阻断tet(x4)与替加环素的结合，从而解决耐药性问题。

2、本发明的第一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，和/或，轻链可变区的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3。

3、其中，cdr-h1的氨基酸序列包含seq id no：1或10所示的氨基酸序列，或与seq idno：1或10具有80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性；cdr-h2的氨基酸序列包含seq id no：2、11或26所示的氨基酸序列，或与seq id no：2、11或26具有80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性；cdr-h3的氨基酸序列包含seq id no：3或12的氨基酸序列，或与seq id no：3或12具有80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性；cdr-l1的氨基酸序列包含seq id no：4、7、13、27、28或29所示的氨基酸序列，或与seq id no：4、7、13、27、28或29具有80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性；cdr-l2的氨基酸序列包含seq id no：5、8、14或30所示的氨基酸序列，或与seq id no：5、8、14或30具有80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性；cdr-l3的氨基酸序列包含seq id no：6、9、15或31所示的氨基酸序列，或与seq idno：6、9、15或31具有80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性。

4、在本发明的一个具体实施方式中，cdr-h1的氨基酸序列包含seq id no：1所示的氨基酸序列；cdr-h2的氨基酸序列包含seq id no：2所示的氨基酸序列；cdr-h3的氨基酸序列包含seq id no：3的氨基酸序列；cdr-l1的氨基酸序列包含seq id no：4、7、28或29所示的氨基酸序列；cdr-l2的氨基酸序列包含seq id no：5、8或30所示的氨基酸序列；cdr-l3的氨基酸序列包含seq id no：6或9所示的氨基酸序列。

5、在本发明的一个具体实施方式中，cdr-h1的氨基酸序列包含seq id no：10所示的氨基酸序列；cdr-h2的氨基酸序列包含seq id no：11或26所示的氨基酸序列；cdr-h3的氨基酸序列包含seq id no：12的氨基酸序列；cdr-l1的氨基酸序列包含seq id no：13或27所示的氨基酸序列；cdr-l2的氨基酸序列包含seq id no：14所示的氨基酸序列；cdr-l3的氨基酸序列包含seq id no：15或31所示的氨基酸序列。

6、在本发明的一个具体实施方式中，cdr-h1的氨基酸序列包含seq id no：1所示的氨基酸序列；cdr-h2的氨基酸序列包含seq id no：2所示的氨基酸序列；cdr-h3的氨基酸序列包含seq id no：3的氨基酸序列；cdr-l1的氨基酸序列包含seq id no：4或7所示的氨基酸序列；cdr-l2的氨基酸序列包含seq id no：5或8所示的氨基酸序列；cdr-l3的氨基酸序列包含seq id no：6或9所示的氨基酸序列。

7、在本发明的一个具体实施方式中，cdr-h1的氨基酸序列包含seq id no：10所示的氨基酸序列；cdr-h2的氨基酸序列包含seq id no：11所示的氨基酸序列；cdr-h3的氨基酸序列包含seq id no：12的氨基酸序列；cdr-l1的氨基酸序列包含seq id no：13所示的氨基酸序列；cdr-l2的氨基酸序列包含seq id no：14所示的氨基酸序列；cdr-l3的氨基酸序列包含seq id no：15所示的氨基酸序列。

8、在本发明的一个具体实施方式中，cdr-h1的氨基酸序列包含seq id no：1所示的氨基酸序列；cdr-h2的氨基酸序列包含seq id no：2所示的氨基酸序列；cdr-h3的氨基酸序列包含seq id no：3的氨基酸序列；cdr-l1的氨基酸序列包含seq id no：4所示的氨基酸序列；cdr-l2的氨基酸序列包含seq id no：5所示的氨基酸序列；cdr-l3的氨基酸序列包含seq id no：6所示的氨基酸序列。

9、在本发明的一个具体实施方式中，cdr-h1的氨基酸序列包含seq id no：1所示的氨基酸序列；cdr-h2的氨基酸序列包含seq id no：2所示的氨基酸序列；cdr-h3的氨基酸序列包含seq id no：3的氨基酸序列；cdr-l1的氨基酸序列包含seq id no：7所示的氨基酸序列；cdr-l2的氨基酸序列包含seq id no：8所示的氨基酸序列；cdr-l3的氨基酸序列包含seq id no：9所示的氨基酸序列。

10、优选的，所述的cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列以从n端到c端的顺序排列。

11、优选的，所述的cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列以从n端到c端的顺序排列。

12、优选的，重链可变区的氨基酸序列包含seq id no：16或19所示氨基酸序列，或与seq id no：16或19具有80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性。

13、优选的，轻链可变区的氨基酸序列包含seq id no：17、18或20所示氨基酸序列，或与seq id no：17、18或20具有80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性。

14、在本发明的一个具体实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含seq id no：16，轻链可变区包含seq id no：17或18。

15、在本发明的一个具体实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含seq id no：19，轻链可变区包含seq id no：20。

16、优选的，所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合可转移替加环素耐药蛋白(简称tet(x4))。

17、优选的，所述的抗体或其抗原结合片段的结构为fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2、单结构域抗体或单链抗体。

18、本发明的第二方面，提供了一种核酸，所述的核酸编码上述的抗体或其抗原结合片段、上述的cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、或上述的重链可变区或轻链可变区。

19、优选的，编码重链可变区的核苷酸序列包含seq id no：21或24，或与seq id no：21或24具有80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性。

20、优选的，编码轻链可变区的核苷酸序列包含seq id no：22、23或25，或与seq idno：22、23或25具有80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性。

21、本发明的第三方面，提供了一种制备tet(x4)重组蛋白的方法。

22、所述的方法包括将包含编码tet(x4)重组蛋白的核苷酸序列的重组质粒导入宿主细胞中。

23、优选的，所述的宿主细胞为原核的，例如大肠杆菌。

24、本发明的第四方面，提供了一种重组质粒，所述的重组质粒包括编码tet(x4)重组蛋白的核苷酸序列。

25、本发明的第五方面，提供了一种包含编码tet(x4)重组蛋白的核苷酸序列或包含上述重组质粒或包含上述核酸的细胞。

26、本发明的第六方面，提供了一种上述方法制备的tet(x4)重组蛋白。

27、本发明的第七方面，提供了一种杂交瘤细胞。

28、优选的，所述的杂交瘤细胞产生上述的抗体或其抗原结合片段。

29、本发明的第八方面，提供了一种杂交瘤细胞的制备方法。

30、所述的制备方法包括使用tet(x4)重组蛋白免疫小鼠，并分离脾细胞，与骨髓瘤细胞融合。

31、本发明的第九方面，提供了一种药物或诊断试剂盒，所述的药物或诊断试剂盒包含上述的抗体或其抗原结合片段、上述的核酸或上述的杂交瘤细胞。

32、本发明的第十方面，提供了一种上述的抗体或其抗原结合片段、上述的核酸、上述的杂交瘤细胞或上述的药物或诊断试剂盒的应用，所述的应用包括：

33、a)在制备治疗革兰氏阴性菌引起的疾病的产品中的应用；或

34、b)在制备抵抗替加环素耐药性的产品中的应用。

35、优选的，所述的革兰氏阴性菌包括但不限于肠道细菌的革兰氏阴性菌(大肠杆菌(e.coli)、克雷伯杆菌属(klebsiella)、灵杆菌(serratia)、肠道细菌属(enterobacter)、柠檬酸细菌属(citrobacter)、摩根菌属(morganella)、普罗威登斯菌属(providencia)、变形菌(proteus)等)、寄居于呼吸系统中的革兰氏阴性菌(嗜血杆菌属(haemophilus)、莫拉菌属(moraxella)等)以及葡萄糖非发酵的革兰氏阴性菌(绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)、假单胞菌属(pseudomonas)、寡养单胞菌属(stenotrophomonas)、伯克氏菌属(burkholderia)、不动杆菌属(acinetobacter)等)。

36、本发明的第十一方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物包含与药物共价结合的上述抗体或其抗原结合片段。

37、优选的，所述的药物可以为化学合成药、抗生素或者各种生物药。优选为抗生素，例如替加环素等。

38、本发明的第十二方面，提供了一种tet(x4)蛋白的检测方法，所述的检测方法包括将待检测样品与本技术所述的抗体或其抗原结合片段接触，然后检测tet(x4)蛋白与抗体或其抗原结合片段形成的复合物。

39、优选的，所述的检测方法检测tet(x4)蛋白的存在或含量。其中，所述的存在表示有无，所述的含量可以为表达量或蛋白浓度等。

40、优选的，所述的抗体或其抗原结合片段可以包含可选择的标记。

41、本发明所述的“抗原结合片段”是保留完整抗体的特定结合活性的抗体的一部分，即抗体的任何部分能够与完整抗体的靶分子上的表位特异结合。它包括例如fab，fab'，f(ab')2和这些片段的变体。例如，完整抗体的重链和/或轻链cdr、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链，或来自完整抗体的重链或轻链的单个cdr。

42、本发明所述的“cdr”代表互补决定区(complementarity-determining region)，其可以由现有技术常用的kabat编号、chothia编号、imgt编号、aho编号(honegger编号)方案确定。

43、本发明所述的“包含”在本技术中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

44、本发明所述的“同一性”是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以在不改变原序列结构或活性的前提下，根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与本发明所述的具体序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％、100％的同一性。

45、利用原核表达技术获得了重组质粒，在大肠杆菌中大量表达获得了tet(x4)重组蛋白，使用蛋白纯化仪得到了高纯度蛋白。通过不同的温度诱导，得出tet(x4)蛋白的可溶性表达量在20℃和37℃无明显区别，纯化后的蛋白具有良好的生物活性。随后的单抗制备及验证过程中，共免疫4只小鼠，免疫完成后根据检测效价情况选择“左”小鼠冲击进行融合实验。融合后通过抗原筛选复检最终保留阳性克隆株34株用于亚克隆，收集亚克隆上清30株，并进行做亲和力排序。最终选择5d3d3用于打腹水进行抗体制备，得到的抗体分别进行重组抗原的sds-page及wb检测，均呈现出清晰条带。单克隆抗体是由淋巴细胞分泌的一种仅针对某一特定抗原表位的抗体，特异性好、亲和力强。本研究利用原核表达系统制备出高纯度的tet(x4)蛋白，并获得其单克隆抗体，可为进一步解释tet(x4)耐药菌株的耐药机制、控制其在全球范围内的流行提供基础。