一种胶原蛋白制备方法及其在抗衰老中的用途与流程

本技术涉及生物领域，具体的涉及一种胶原蛋白制备方法及其在抗衰老中的用途。本技术涉及生物领域，具体的涉及胶原蛋白肽与pten单克隆抗体组合物在抗衰老的用途。

背景技术：

1、随着人口老龄化程度的不断加深，我国已正式迈入老龄化社会。预计 2010-2030年，仅人口增长和老龄化就会使心血管病事件的发生数预计上升50％以上。目前，心脑血管疾病的发病在逐年增加，这些疾病合计占年龄相关疾病的约39.6％。越来越多的证据表明，年龄是心脑血管疾病发生、发展的主要危险因素，而血管老化在其中发挥了重要的作用，其中血管内皮细胞的衰老又是主要的原因。

2、血管内皮细胞vec为衬贴于血管腔表面的扁平鳞状上皮细胞，呈单层纵向排列，是人体最大的组织；其生物学功能多样，可构成血流与血管壁之间的选择性通透屏障，具有调节血管通透性和血管张力，维持凝血功能平衡，感受血管应切力，对细胞损伤作出反应，分泌多种活性物质等作用。vec衰老主要包括细胞复制性衰老和应激诱发的细胞早衰2种方式。因细胞基因异常(如各种类型的dna 损伤)引起的细胞分裂停止称为细胞复制性衰老；体外培养的细胞在没有受到任何应激和损伤的条件下，经过一系列的传代之后，逐渐衰老，即复制性衰老。细胞受到某些外界因素的影响而造成永久的、不可逆转的增殖停滞，则称为早衰；应用高糖、肿瘤坏死因子等处理体外培养的细胞，即可诱导细胞早衰。

3、目前认为，很多系统性疾病，如高血压、冠心病、糖尿病等均与vec衰老、损伤有关；一些刺激因素，如吸烟、放射性损伤等均可引起内皮细胞衰老性改变，虽然不同因素对内皮细胞的作用机制各不相同，但最终都进入细胞衰老的共同途径。其中研究表明pi3k/akt信号通路可以影响多种下游效应分子的活化状态，发挥抑制凋亡、促进增殖的作用，是细胞内重要的信号转导通路之一。li等用含有血管紧张素2的培养基体外培养人脐静脉内皮细胞1周，结果显示，血管紧张素2呈剂量依赖性，使线粒体膜电位去极化，增加ros产生，显著增加tert、解耦连蛋白2(uncouplingprotein2，ucp2)、akt、p-akt、p53等蛋白的表达水平，加速细胞衰老程度。pi3k抑制剂ly294002可减缓其诱导的内皮细胞衰老及凋亡。表明血管紧张素2通过pi3k/akt/ucp2途径诱导vec衰老。

4、pten做为一种抑癌基因，自1997年发现以来即受到广泛关注，其主要调控磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylin0sitol3kinase，pi3k)/蛋白激酶b(akt)信号通路的平衡。在人类多种肿瘤如神经胶质瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、黑色素瘤中，都存在着pten基因表达和功能的异常。pten蛋白功能缺失后，失去了对pi3k/akt的负调控，致使akt过度活化，进而促进癌细胞的增殖、转移、侵袭、血管生成及干细胞的自我更新。

5、pten基因的编码蛋白-脂质磷酸酶的活性对调控细胞凋亡有重要的作用，它可快速使细胞周期阻滞在g1期，从而促进了细胞凋亡。pten基因可使磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸[ph0sphatidylinositol(3，4，5)一trisphosphate，pip3]处于较低水平，从而抑制pi3k/akt通路，诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡。一旦pten 基因功能缺失，失去对pi3k/akt的负调控致使akt过度活化，必然导致细胞周期加速，细胞生长繁殖增快。pi3k/akt通路的活化能降低凋亡因子的活性，并可增加抗凋亡蛋白的活性。有研究发现，pten-pi3k/akt信号通路下游的许多基质在调控细胞增殖和凋亡过程中起重要作用。过度活化的akt还可能通过下调周期依赖性激素抑制剂p27及上调细胞周期蛋白d1而促进细胞增殖。研究发现pten-pi3k/akt信号通路可调控口腔鳞状细胞癌细胞的增殖。通过对舌癌的研究也发现过表达pten基因可通过负调控pi3k/akt通路来诱导舌癌细胞的凋亡。

6、研究表明高糖通过上调pten诱导内皮细胞凋亡，pic是pten的抑制剂、蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制剂，较小的剂量就可以抑制pten，调节pi3k/akt 信号通路。pten抑制剂可以降低高糖诱导的内皮细胞衰老。但是目前，针对 pten抑制剂的研究还不够多，特别是针对pten的单克隆抗体的研究也不够多。

7、胶原蛋白属于结构性蛋白，是一种多糖蛋白，性状呈白色，含有少量的半乳糖和葡萄糖，是细胞外基质的最主要成分，是在晡乳动物中含量最多。胶原蛋白在人体的组织器官随处可见，比如皮肤、筋膜、韧带、头发、骨骼、肌肉、关节、软骨等部位，其中皮肤中的真皮含量是最多的，起着支撑、修复、保护的三重抗衰老作用。真皮层中的胶原蛋白是由成纤维细胞进行合成和分泌的，充足的胶原蛋白可以保持皮肤弹性，减少水分流失、延缓皱纹产生和色素沉淀。研究表明，胶原蛋白多肽能有效促进氧化应激损伤的血管内皮细胞增殖，抑制内皮细胞的凋亡，保护血管内皮细胞。但是目前针对胶原蛋白保护血管内皮细胞的研究也还不够充分，提供的胶原蛋白种类也不够多。

技术实现思路

1、本发明一方面提供一种特异性针对pten的单克隆抗体。

2、一方面，所述的pten的单克隆抗体为p2a3，其轻链可变区序列为seq id no：1所示，其重链可变区序列为seq id no：2所示。

3、进一步的，本发明的单克隆抗体还可以进行适当的保守氨基酸取代，所述取代后的抗体仍然保持相应的活性。

4、另外，关于本发明的单克隆抗体，改变后的氨基酸数量优选为10个氨基酸以内，更优选为5个氨基酸以内，更优选为3个氨基酸以内(例如，2个氨基酸以内，1个氨基酸)，即，在本说明书中，所谓“多个氨基酸”，优选为10个以下的氨基酸，更优选为5个以下的氨基酸，更优选为3个以下，更优选为2个以下。例如，在酸性氨基酸(天冬氨酸及谷氨酸)，碱性氨基酸(赖氨酸·精氨酸·组氨酸)，中性氨基酸中，具有烃链的氨基酸(甘氨酸·丙氨酸·巴林·罗伊辛·异亮氨酸·脯氨酸)，具有羟基的氨基酸(丝氨酸·特氨酸)，含有硫磺的氨基酸(半胱氨酸甲氨酸)。

5、进一步的，本发明的单克隆抗体可以在轻链可变区序列seq id no：1基础上保持99％的序列同一性的修饰的单克隆抗体。

6、进一步的，本发明的单克隆抗体可以在轻链可变区序列seq id no：1基础上保持98％的序列同一性的修饰的单克隆抗体。

7、进一步的，本发明的单克隆抗体可以在轻链可变区序列seq id no：1基础上保持97％的序列同一性的修饰的单克隆抗体。

8、进一步的，本发明的单克隆抗体可以在轻链可变区序列seq id no：1基础上保持96％的序列同一性的修饰的单克隆抗体。

9、进一步的，本发明的单克隆抗体可以在轻链可变区序列seq id no：1基础上保持95％的序列同一性的修饰的单克隆抗体。

10、进一步的，本发明的单克隆抗体在制备用于抑制pten表达的试剂中的用途。

11、进一步的，本发明的单克隆抗体在制备用于治疗与pten过表达相关疾病的药物中的用途。

12、进一步的，本发明的单克隆抗体在制备用于治疗高糖环境下内皮细胞衰老的药物中的用途。

13、进一步的，本发明的单克隆抗体在制备用于治疗糖尿病患者血管衰老的药物中的用途。

14、进一步的，本发明还提供了一种具有抗氧化、抗衰老作用的胶原蛋白肽。

15、进一步的，所述胶原蛋白肽是通过鳀鱼皮提取获得的。

16、进一步的，所述胶原蛋白肽的提取方法包括将购得的鳀鱼洗净剥皮，得到干净的鳀鱼皮。将得到的鳀鱼皮置于乙醚中浸泡，去除鳀鱼皮中的脂肪，再用清水冲洗数次，然后晾干。将晾干的鳀鱼皮切碎，得到鳀鱼皮粉末，取一只干燥洁净的烧杯，放在电子天平上，取鳀鱼皮，加水，在100℃水浴锅下放置，然后调节ph。酶解：分别依次加入0.2％的碱性蛋白酶和0.3％中性蛋白酶，并且调节水浴锅的温度为45摄氏度，依次分别酶解3h。灭活：酶解后取出，将水浴锅温度调节至100℃后，放置水浴锅中灭活10min。离心过滤：将灭活后的酶解液离心过滤得到上清液。将得到的上清液冷冻干燥，得到胶原蛋白肽(白色粉末)。

17、进一步的，本发明还提供了本发明的单克隆抗体和胶原蛋白肽在制备治疗高糖环境下内皮细胞衰老的药盒中的用途。

18、进一步的，所述药盒中含有药学上可接受的载体。

19、进一步的，本发明的药盒、药物可包含药学上可接受的载体。适于口服给药的药学上可接受的载体的例子包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，染料和香料。对于注射制剂，可以联合使用缓冲剂，防腐剂，止痛剂，增溶剂，等渗剂和稳定剂。对于局部给药，该组合物还可包含碱，赋形剂，润滑剂和/或防腐剂。本发明的药物组合物可与药学上可接受的载体一起配制成各种剂型。例如，该组合物可以是片剂，片剂，胶囊，酏剂，混悬剂，糖浆剂或晶圆的口服剂型。对于注射，该组合物可配制成单位剂量安瓿形式或多剂量安瓿形式。此外，该组合物可应用于溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶囊和悬浮液释放形式。适用于该组合物制剂的载体，赋形剂或稀释剂的例子包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，甲基纤维素，无定形纤维素，聚吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯，羟基苯甲酸丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。可另外使用填料，抗凝剂，润滑剂，润湿剂，香料和/或防腐剂。根据本发明的药物组合物的有效剂量取决于各种因素，包括癌症的种类，给药途径，患者的年龄，性别和体重，以及疾病的严重程度等。

20、在一个优选的实施方案中，本发明的组合物可进一步包含可与本发明的人单克隆抗体缀合的治疗剂。该治疗剂选自放射性核素，药物，淋巴因子，毒素和双特异性抗体。药物或毒素的例子包括依托泊苷，替尼泊苷，阿霉素，柔红霉素，卡米霉素，氨基蝶呤，放线菌素，丝裂霉素，顺铂和顺铂类似物，博来霉素，埃坡霉素，5-氟尿嘧啶，美法仑和氮芥，或者其他用于治疗血管老化抗衰老的药物，但不限于此。

21、在用于抑制pten过表达相关癌症生长和转移或用于治疗或预防癌症的组合物和试剂盒中，pten特异性人单克隆抗体或其功能片段用于抑制pten在各种癌症中的功能，从而抑制癌症的生长和转移，从而杀死肿瘤细胞。优选地，癌症的治疗或预防是通过调节癌症的增殖，迁移或侵袭来实现的。优选地，所述癌症是胰腺癌，胃癌，卵巢癌或结肠直肠癌。

22、更详细地，本发明的方法包括以药学有效剂量将药物组合物给予身体。该药物组合物可以胃肠外，皮下，肺内或鼻内给药。对于局部免疫抑制治疗，如果需要，该组合物可以使用合适的方法给药，包括瘤内给药。胃肠外注射包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内和皮下途径。优选的给药方式包括静脉内，皮下，皮内，肌肉内和滴注注射。

23、有益效果

24、本发明通过从鳀鱼皮中分离制备得到了具有抗氧化、抗衰老作用的胶原蛋白肽，将胶原蛋白肽与制备的pten单克隆抗体一起使用后，能够有效地抑制高糖环境下内皮细胞的衰老，具有较好的用于糖尿病患者血管抗衰老的应用。具有极好的应用价值。