用于检测γ干扰素的抗体组合及其应用的制作方法

用于检测
γ
干扰素的抗体组合及其应用
技术领域
1.本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及用于检测γ干扰素的抗体组合及其应用。
技术背景
2.干扰素是一类糖蛋白，它具有高度的种属特异性，故动物的干扰素对人无效，干扰素具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫及抗肿瘤作用。
3.1957年isaacs和lindenmann首先发现了病毒干扰现象，即病毒感染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞干扰病毒的复制，因而命名为干扰素。目前已知干扰素并不能直接杀伤病毒，而是诱导宿主细胞产生数种酶，干扰病毒的基因转录或病毒蛋白组分的翻译。
4.根据产生干扰素细胞来源不同、理化性质和生物学活性的差异，可分为α-干扰素(interferonα，ifn-α)、β-干扰素(interferonβ，ifn-β)和γ-干扰素(interferonγ，ifn-γ)。
5.ifn-γ的生物学活性：
6.ifn-γ生物学作用有较严格的种属特异性，人ifn-γ只作用于人或灵长类动物的细胞，其作用方式具体为：
7.(1)诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞、星状细胞等mhcⅱ类抗原的表达，使其参与抗原提呈和特异性免疫的识别过程；此外，ifn-γ可上调内皮细胞icam-1(cd54)表达，促进巨噬细胞fcγr表达，协同诱导tnf并促进巨噬细胞杀伤病原微生物；其次，在一些免疫性疾病中，ifn-γ水平表现出异常，例如：狼疮肾炎患者血清中ifn-γ水平显著升高，导致患者组织损伤。
8.(2)促进lps体外刺激小鼠b细胞分泌和igg2a，降低igg1、igg2b、igg3和ige的产生；抑制由il-4诱导小鼠b细胞增殖，igg1和ige产生以及fcεrⅱ表达；促进sac诱导的人b细胞的增殖；
9.(3)协同il-2诱导lak活性，促进t细胞il-2r表达；
10.(4)诱导急性期蛋白合成，诱导髓样细胞分化。
11.但由于正常人血液中ifn-γ的浓度约为10.57
±
3.58ng/ml，现有针对ifn-γ的生物制品多为低亲和力抗体，其对ifn-γ的检测准确度低、灵敏度也不高。


技术实现要素：

12.针对上述存在的拘束局限性，本发明提出了一种用于检测γ干扰素的抗体组合及其应用；克服了

背景技术：
中提到的不足和缺陷。
13.为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
14.本发明的发明点是提供了一种用于检测γ干扰素(ifn-γ)的抗体组合，所述抗体组合包括有第一抗体和/或第二抗体，所述第一抗体重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no.1的第26-36、56-63、105-116位氨基酸序列所示，轻链可变区
cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no.2的第23-36、52-58、91-100位氨基酸序列所示；所述第二抗体重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no.3的第26-34、54-61、103-113位氨基酸序列所示，轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no.4的第23-35、51-59、92-99位氨基酸序列所示。
15.第一抗体是29g2，第二抗体为25b6。
16.第一抗体重链可变区的cdr1为：gvarsittrsy；
17.第一抗体重链可变区的cdr2为：ndynydgd；
18.第一抗体重链可变区的cdr3为：dpdaatgfhpdy；
19.第一抗体轻链可变区的cdr1为：aganndigtyayvs；
20.第一抗体轻链可变区的cdr2为：kvttras；
21.第一抗体轻链可变区的cdr3为：asyrnfnnav；
22.第二抗体重链可变区的cdr1为：gtfdqtssy；
23.第二抗体重链可变区的cdr2为：savvptgs；
24.第二抗体重链可变区的cdr3为：ragnyntygdy；
25.第二抗体轻链可变区的cdr1为：glsvtastdyppg；
26.第二抗体轻链可变区的cdr2为：svpndawss；
27.第二抗体轻链可变区的cdr3为：alqirkte。
28.在一个优选的实施方案中，用于检测γ干扰素的抗体组合，所述第一抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示或为与seq id no.1序列同源性大于90％的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示或为与seq id no.2序列同源性大于90％的氨基酸序列；所述第二抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示或为与seq id no.3序列同源性大于90％的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示或为与seq id no.4序列同源性大于90％的氨基酸序列。
29.第一抗体重链可变区氨基酸序列seq id no.1为：
30.evqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgvarsittrsyawswirqppgkglewmgvindynydgdtyyspslksrtsiswdtsknqfslqlssvtpedtavyycardpdaatgfhpdywgqgtqvtvss；
31.第一抗体轻链可变区氨基酸序列seq id no.2为：
32.qavltqpplvsgtpgqtvtiscaganndigtyayvswyqqlpgtapklliykvttrasgipsrfsgsksgntasltisglqsedeadyycasyrnfnnavfgrgthltvlgqpka；
33.第二抗体重链可变区氨基酸序列seq id no.3为：
34.evqlvesggglvqpggslrlscaasgtfdqtssyrmywvrqppgkglewvsaisavvptgstyygdsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycanragnyntygdywgqgtqvtvss；
35.第二抗体轻链可变区氨基酸序列seq id no.4为：
36.qtvvtqepslsvspggtvtltcglsvtastdyppgwfqqtpgqapraliysvpndawssgvpsrfsgsisgnkaaltitgaqpedeadyycalqirktefgggthltvlgqpka。
37.在一个优选的实施方案中，用于检测γ干扰素的抗体组合，所述第一抗体的重链恒定区的氨基酸序列如seq id no.5所示或为与seq id no.5序列同源性大于90％的氨基酸序列，轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no.6所示或为与seq id no.6序列同源性大于90％的氨基酸序列；所述第二抗体的重链恒定区的氨基酸序列如seq id no.7所示或为与
seq id no.7序列同源性大于90％的氨基酸序列，轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no.8所示或为与seq id no.8序列同源性大于90％的氨基酸序列。
38.第一抗体重链恒定区氨基酸序列seq id no.5为：
39.astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；
40.第一抗体轻链恒定区氨基酸序列seq id no.6为：
41.gqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs；
42.第二抗体重链恒定区氨基酸序列seq id no.7为：
43.astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；
44.第二抗体轻链恒定区氨基酸序列seq id no.8为：
45.gqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs。
46.用于检测γ干扰素的抗体组合，所述第一抗体和第二抗体独立的为包被抗体或检测抗体。
47.进一步的，上述的用于检测γ干扰素的抗体组合，所述抗体组合选自以下任意一种组合形式：第一抗体做为检测抗体、第二抗体做为检测抗体、第一抗体做为包被抗体+第二抗体做为检测抗体、第二抗体做为包被抗体+第一抗体做为检测抗体；优选为第一抗体做为包被抗体+第二抗体做为检测抗体。
48.也即是说，第一抗体和第二抗体都可以单独的做为γ干扰素的检测抗体，此时可采用常规的单抗检测方法以第一抗体或第二抗体进行γ干扰素的检测，同时，也可将第一抗体做为包被抗体、第二抗体做为检测抗体，以双抗夹心的方法进行γ干扰素的检测；或将第二抗体做为包被抗体、第一抗体做为检测抗体，以双抗夹心的方法进行γ干扰素的检测。
49.本发明的第二个发明点是提供了一种编码上述的用于检测γ干扰素的抗体组合的重链和轻链的多核苷酸，编码所述第一抗体的重链可变区的多核苷酸序列如seq id no.9所示或为与seq id no.9序列同源性大于90％的核苷酸序列，编码所述第一抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如seq id no.10所示或为与seq id no.10序列同源性大于90％的核苷酸序列；编码所述第二抗体的重链可变区的多核苷酸序列如seq id no.11所示或为与seq id no.11序列同源性大于90％的核苷酸序列，编码所述第二抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如seq id no.12所示或为与seq id no.12序列同源性大于90％的核苷酸序列。
50.编码第一抗体重链可变区的多核苷酸序列seq id no.9为：
51.gaagtgcagctgcaggaaagcggcccgggcctggtgaaaccgagccagaccctgagcctgacctgcac
cgtgagcggcgtggcgcgcagcattaccacccgcagctatgcgtggagctggattcgccagccgccgggcaaaggcctggaatggatgggcgtgattaacgattataactatgatggcgatacctattatagcccgagcctgaaaagccgcaccagcattagctgggataccagcaaaaaccagtttagcctgcagctgagcagcgtgaccccggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgatccggatgcggcgaccggctttcatccggattattggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagc；
52.编码第一抗体轻链可变区的多核苷酸序列seq id no.10为：
53.caggcggtgctgacccagccgccgctggtgagcggcaccccgggccagaccgtgaccattagctgcgcgggcgcgaacaacgatattggcacctatgcgtatgtgagctggtatcagcagctgccgggcaccgcgccgaaactgctgatttataaagtgaccacccgcgcgagcggcattccgagccgctttagcggcagcaaaagcggcaacaccgcgagcctgaccattagcggcctgcagagcgaagatgaagcggattattattgcgcgagctatcgcaactttaacaacgcggtgtttggccgcggcacccatctgaccgtgctgggccagccgaaagcg；
54.编码第二抗体重链可变区的多核苷酸序列seq id no.11为：
55.gaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggcacctttgatcagaccagcagctatcgcatgtattgggtgcgccagccgccgggcaaaggcctggaatgggtgagcgcgattagcgcggtggtgccgaccggcagcacctattatggcgatagcgtgaaaggccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacaccgtgtatctgcagatgaacagcctgaaaccggaagataccgcggtgtattattgcgcgaaccgcgcgggcaactataacacctatggcgattattggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagc；
56.编码第二抗体轻链可变区的多核苷酸序列seq id no.12为：
57.cagaccgtggtgacccaggaaccgagcctgagcgtgagcccgggcggcaccgtgaccctgacctgcggcctgagcgtgaccgcgagcaccgattatccgccgggctggtttcagcagaccccgggccaggcgccgcgcgcgctgatttatagcgtgccgaacgatgcgtggagcagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcattagcggcaacaaagcggcgctgaccattaccggcgcgcagccggaagatgaagcggattattattgcgcgctgcagattcgcaaaaccgaatttggcggcggcacccatctgaccgtgctgggccagccgaaagcg。
58.在一个优选的实施方案中，用于检测γ干扰素的抗体组合的重链和轻链的多核苷酸，编码所述第一抗体的重链恒定区的多核苷酸序列如seq id no.13所示或为与seq id no.13序列同源性大于90％的核苷酸序列，编码所述第一抗体的轻链恒定区的多核苷酸序列如seq id no.14所示或为与seq id no.14序列同源性大于90％的核苷酸序列；编码所述第二抗体的重链恒定区的多核苷酸序列如seq id no.15所示或为与seq id no.15序列同源性大于90％的核苷酸序列，编码所述第二抗体的轻链恒定区的多核苷酸序列如seq id no.16所示或为与seq id no.16序列同源性大于90％的核苷酸序列。
59.编码第一抗体重链恒定区的多核苷酸序列seq id no.13为：
60.gcgagcaccaaaggcccgagcgtgtttccgctggcgccgagcagcaaaagcaccagcggcggcaccgcggcgctgggctgcctggtgaaagattattttccggaaccggtgaccgtgagctggaacagcggcgcgctgaccagcggcgtgcatacctttccggcggtgctgcagagcagcggcctgtatagcctgagcagcgtggtgaccgtgccgagcagcagcctgggcacccagacctatatttgcaacgtgaaccataaaccgagcaacaccaaagtggataaaaaagtggaaccgaaaagctgcgataaaacccatacctgcccgccgtgcccggcgccggaactgctgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccatgaagatccggaagtgaaatttaactggtatgtggatggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtataacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaa
gaatataaatgcaaagtgagcaacaaagcgctgccggcgccgattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgcgatgaactgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcaaa；
61.编码第一抗体轻链恒定区的多核苷酸序列seq id no.14为：
62.ggccagccgaaagcggcgccgagcgtgaccctgtttccgccgagcagcgaagaactgcaggcgaacaaagcgaccctggtgtgcctgattagcgatttttatccgggcgcggtgaccgtggcgtggaaagcggatagcagcccggtgaaagcgggcgtggaaaccaccaccccgagcaaacagagcaacaacaaatatgcggcgagcagctatctgagcctgaccccggaacagtggaaaagccatcgcagctatagctgccaggtgacccatgaaggcagcaccgtggaaaaaaccgtggcgccgaccgaatgcagc；
63.编码第二抗体重链恒定区的多核苷酸序列seq id no.15为：
64.gcgagcaccaaaggcccgagcgtgtttccgctggcgccgagcagcaaaagcaccagcggcggcaccgcggcgctgggctgcctggtgaaagattattttccggaaccggtgaccgtgagctggaacagcggcgcgctgaccagcggcgtgcatacctttccggcggtgctgcagagcagcggcctgtatagcctgagcagcgtggtgaccgtgccgagcagcagcctgggcacccagacctatatttgcaacgtgaaccataaaccgagcaacaccaaagtggataaaaaagtggaaccgaaaagctgcgataaaacccatacctgcccgccgtgcccggcgccggaactgctgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccatgaagatccggaagtgaaatttaactggtatgtggatggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtataacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaagcgctgccggcgccgattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgcgatgaactgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcaaa；
65.编码第二抗体轻链恒定区的多核苷酸序列seq id no.16为：
66.ggccagccgaaagcggcgccgagcgtgaccctgtttccgccgagcagcgaagaactgcaggcgaacaaagcgaccctggtgtgcctgattagcgatttttatccgggcgcggtgaccgtggcgtggaaagcggatagcagcccggtgaaagcgggcgtggaaaccaccaccccgagcaaacagagcaacaacaaatatgcggcgagcagctatctgagcctgaccccggaacagtggaaaagccatcgcagctatagctgccaggtgacccatgaaggcagcaccgtggaaaaaaccgtggcgccgaccgaatgcagc。
67.本发明的第三个发明点是提供了上述用于检测γ干扰素的抗体组合的重链和轻链的多核苷酸的表达系统，所述表达系统为哺乳动物表达载体。
68.在一个优选的实施方案中，上述的表达系统，所述γ干扰素的抗原表达系统为expi 293表达系统。
69.在一个优选的实施方案中，上述的表达系统，所述抗体表达系统为cho表达系统。
70.本发明的第四个发明点是提供了一种含有上述的表达系统的宿主细胞。
71.本发明的第五个发明点是提供了上述的抗体组合在制备用于体外定量检测γ干扰素含量的生物制品中的应用。
72.在一个优选的实施方案中，上述的应用，所述体外定量检测是指检测血清、血浆、全血和/或末梢血中γ干扰素的含量。
73.在一个优选的实施方案中，上述的应用，所述生物制品为试剂盒。
74.在一个优选的实施方案中，上述的应用，所述试剂盒为双抗体夹心法检测试剂盒。
75.与现有技术相对比，本发明具有以下优点：
76.本发明提供的用于检测γ干扰素的抗体组合及其应用，抗体组合对于γ干扰素抗原的亲和力强、检测灵敏度高、使用简便、检测快速稳定；正常人血液中ifn-γ的浓度约为10.57
±
3.58ng/ml，现有的常规低亲和力抗体针对此种情况难以实现有效的检测，而本发明的提供的高亲和力抗体组合和含有此抗体组合的采用双抗体夹心方法的γ干扰素定量检测试剂盒，能够有效实现超低浓度γ干扰素的定量检测，经验证，试剂盒的灵敏度可达到2.8pg/ml。
77.本发明采用的双抗体夹心法测定样本中ifn-γ水平，也即是酶标板上包被的抗体与检测抗体和被测样品的ifn-γ形成了“包被抗体-抗原-检测抗体”的夹心复合物结构，更有利于ifn-γ的检出。另外本发明有效地采用亲和素-生物素-酶复合物实现了检测的高灵敏度。
78.本发明的检测试剂盒不仅可以快速、准确地测定血清中ifn-γ的含量，为炎症的早期诊断、早期治疗提供了可靠的临床参考价值；而且由于使用了两个特异性单克隆抗体的组合，实现了ifn-γ检测灵敏度的大幅提升。
附图说明
79.图1为本发明一实施例所提供的含有用于检测γ干扰素的抗体组合的elisa试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
80.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
81.除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。
82.为了进一步了解本发明，下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1
83.用于检测γ干扰素(ifn-γ)的抗体组合，抗体组合包括有第一抗体和/或第二抗体，第一抗体重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no.1的第26-36、56-63、105-116位氨基酸序列所示，轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no.2的第23-36、52-58、91-100位氨基酸序列所示；第二抗体重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no.3的第26-34、54-61、103-113位氨基酸序列
所示，轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no.4的第23-35、51-59、92-99位氨基酸序列所示。
84.第一抗体是29g2，第二抗体为25b6。
85.第一抗体重链可变区的cdr1为：gvarsittrsy；
86.第一抗体重链可变区的cdr2为：ndynydgd；
87.第一抗体重链可变区的cdr3为：dpdaatgfhpdy；
88.第一抗体轻链可变区的cdr1为：aganndigtyayvs；
89.第一抗体轻链可变区的cdr2为：kvttras；
90.第一抗体轻链可变区的cdr3为：asyrnfnnav；
91.第二抗体重链可变区的cdr1为：gtfdqtssy；
92.第二抗体重链可变区的cdr2为：savvptgs；
93.第二抗体重链可变区的cdr3为：ragnyntygdy；
94.第二抗体轻链可变区的cdr1为：glsvtastdyppg；
95.第二抗体轻链可变区的cdr2为：svpndawss；
96.第二抗体轻链可变区的cdr3为：alqirkte。
97.抗体组合中，第一抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示或为与seq id no.1序列同源性大于90％的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示或为与seq id no.2序列同源性大于90％的氨基酸序列；第二抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示或为与seq id no.3序列同源性大于90％的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示或为与seq id no.4序列同源性大于90％的氨基酸序列。
98.第一抗体重链可变区氨基酸序列seq id no.1为：
99.evqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgvarsittrsyawswirqppgkglewmgvindynydgdtyyspslksrtsiswdtsknqfslqlssvtpedtavyycardpdaatgfhpdywgqgtqvtvss；
100.第一抗体轻链可变区氨基酸序列seq id no.2为：
101.qavltqpplvsgtpgqtvtiscaganndigtyayvswyqqlpgtapklliykvttrasgipsrfsgsksgntasltisglqsedeadyycasyrnfnnavfgrgthltvlgqpka；
102.第二抗体重链可变区氨基酸序列seq id no.3为：
103.evqlvesggglvqpggslrlscaasgtfdqtssyrmywvrqppgkglewvsaisavvptgstyygdsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycanragnyntygdywgqgtqvtvss；
104.第二抗体轻链可变区氨基酸序列seq id no.4为：
105.qtvvtqepslsvspggtvtltcglsvtastdyppgwfqqtpgqapraliysvpndawssgvpsrfsgsisgnkaaltitgaqpedeadyycalqirktefgggthltvlgqpka。
106.抗体组合中，第一抗体的重链恒定区的氨基酸序列如seq id no.5所示或为与seq id no.5序列同源性大于90％的氨基酸序列，轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no.6所示或为与seq id no.6序列同源性大于90％的氨基酸序列；第二抗体的重链恒定区的氨基酸序列如seq id no.7所示或为与seq id no.7序列同源性大于90％的氨基酸序列，轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no.8所示或为与seq id no.8序列同源性大于90％的氨基酸序列。
107.第一抗体重链恒定区氨基酸序列seq id no.5为：
108.astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；
109.第一抗体轻链恒定区氨基酸序列seq id no.6为：
110.gqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs；
111.第二抗体重链恒定区氨基酸序列seq id no.7为：
112.astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；
113.第二抗体轻链恒定区氨基酸序列seq id no.8为：
114.gqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs。
115.第一抗体和第二抗体独立的为包被抗体或检测抗体。
116.抗体组合选自以下任意一种组合形式：第一抗体做为检测抗体、第二抗体做为检测抗体、第一抗体做为包被抗体+第二抗体做为检测抗体、第二抗体做为包被抗体+第一抗体做为检测抗体；
117.优选为第一抗体29g2做为包被抗体+第二抗体25b6做为检测抗体。
118.也即是说，第一抗体和第二抗体都可以单独的做为γ干扰素的检测抗体，此时可采用常规的单抗检测方法以第一抗体或第二抗体进行γ干扰素的检测，同时，也可将第一抗体做为包被抗体、第二抗体做为检测抗体，以双抗夹心的方法进行γ干扰素的检测；或将第二抗体做为包被抗体、第一抗体做为检测抗体，以双抗夹心的方法进行γ干扰素的检测。
119.本发明还提供了编码上述的用于检测γ干扰素的抗体组合的重链和轻链的多核苷酸，编码第一抗体的重链可变区的多核苷酸序列如seq id no.9所示或为与seq id no.9序列同源性大于90％的核苷酸序列，编码第一抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如seq id no.10所示或为与seq id no.10序列同源性大于90％的核苷酸序列；编码第二抗体的重链可变区的多核苷酸序列如seq id no.11所示或为与seq id no.11序列同源性大于90％的核苷酸序列，编码第二抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如seq id no.12所示或为与seq id no.12序列同源性大于90％的核苷酸序列。
120.编码第一抗体重链可变区的多核苷酸序列seq id no.9为：
121.gaagtgcagctgcaggaaagcggcccgggcctggtgaaaccgagccagaccctgagcctgacctgcaccgtgagcggcgtggcgcgcagcattaccacccgcagctatgcgtggagctggattcgccagccgccgggcaaaggcctggaatggatgggcgtgattaacgattataactatgatggcgatacctattatagcccgagcctgaaaagccgcaccagcattagctgggataccagcaaaaaccagtttagcctgcagctgagcagcgtgaccccggaagataccgcggt
gtattattgcgcgcgcgatccggatgcggcgaccggctttcatccggattattggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagc；
122.编码第一抗体轻链可变区的多核苷酸序列seq id no.10为：
123.caggcggtgctgacccagccgccgctggtgagcggcaccccgggccagaccgtgaccattagctgcgcgggcgcgaacaacgatattggcacctatgcgtatgtgagctggtatcagcagctgccgggcaccgcgccgaaactgctgatttataaagtgaccacccgcgcgagcggcattccgagccgctttagcggcagcaaaagcggcaacaccgcgagcctgaccattagcggcctgcagagcgaagatgaagcggattattattgcgcgagctatcgcaactttaacaacgcggtgtttggccgcggcacccatctgaccgtgctgggccagccgaaagcg；
124.编码第二抗体重链可变区的多核苷酸序列seq id no.11为：
125.gaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggcacctttgatcagaccagcagctatcgcatgtattgggtgcgccagccgccgggcaaaggcctggaatgggtgagcgcgattagcgcggtggtgccgaccggcagcacctattatggcgatagcgtgaaaggccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacaccgtgtatctgcagatgaacagcctgaaaccggaagataccgcggtgtattattgcgcgaaccgcgcgggcaactataacacctatggcgattattggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagc；
126.编码第二抗体轻链可变区的多核苷酸序列seq id no.12为：
127.cagaccgtggtgacccaggaaccgagcctgagcgtgagcccgggcggcaccgtgaccctgacctgcggcctgagcgtgaccgcgagcaccgattatccgccgggctggtttcagcagaccccgggccaggcgccgcgcgcgctgatttatagcgtgccgaacgatgcgtggagcagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcattagcggcaacaaagcggcgctgaccattaccggcgcgcagccggaagatgaagcggattattattgcgcgctgcagattcgcaaaaccgaatttggcggcggcacccatctgaccgtgctgggccagccgaaagcg。
128.用于检测γ干扰素的抗体组合的重链和轻链的多核苷酸，编码第一抗体的重链恒定区的多核苷酸序列如seq id no.13所示或为与seq id no.13序列同源性大于90％的核苷酸序列，编码第一抗体的轻链恒定区的多核苷酸序列如seq id no.14所示或为与seq id no.14序列同源性大于90％的核苷酸序列；编码第二抗体的重链恒定区的多核苷酸序列如seq id no.15所示或为与seq id no.15序列同源性大于90％的核苷酸序列，编码第二抗体的轻链恒定区的多核苷酸序列如seq id no.16所示或为与seq id no.16序列同源性大于90％的核苷酸序列。
129.编码第一抗体重链恒定区的多核苷酸序列seq id no.13为：
130.gcgagcaccaaaggcccgagcgtgtttccgctggcgccgagcagcaaaagcaccagcggcggcaccgcggcgctgggctgcctggtgaaagattattttccggaaccggtgaccgtgagctggaacagcggcgcgctgaccagcggcgtgcatacctttccggcggtgctgcagagcagcggcctgtatagcctgagcagcgtggtgaccgtgccgagcagcagcctgggcacccagacctatatttgcaacgtgaaccataaaccgagcaacaccaaagtggataaaaaagtggaaccgaaaagctgcgataaaacccatacctgcccgccgtgcccggcgccggaactgctgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccatgaagatccggaagtgaaatttaactggtatgtggatggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtataacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaagcgctgccggcgccgattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgcgatgaactgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaacc
accccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcaaa；
131.编码第一抗体轻链恒定区的多核苷酸序列seq id no.14为：
132.ggccagccgaaagcggcgccgagcgtgaccctgtttccgccgagcagcgaagaactgcaggcgaacaaagcgaccctggtgtgcctgattagcgatttttatccgggcgcggtgaccgtggcgtggaaagcggatagcagcccggtgaaagcgggcgtggaaaccaccaccccgagcaaacagagcaacaacaaatatgcggcgagcagctatctgagcctgaccccggaacagtggaaaagccatcgcagctatagctgccaggtgacccatgaaggcagcaccgtggaaaaaaccgtggcgccgaccgaatgcagc；
133.编码第二抗体重链恒定区的多核苷酸序列seq id no.15为：
134.gcgagcaccaaaggcccgagcgtgtttccgctggcgccgagcagcaaaagcaccagcggcggcaccgcggcgctgggctgcctggtgaaagattattttccggaaccggtgaccgtgagctggaacagcggcgcgctgaccagcggcgtgcatacctttccggcggtgctgcagagcagcggcctgtatagcctgagcagcgtggtgaccgtgccgagcagcagcctgggcacccagacctatatttgcaacgtgaaccataaaccgagcaacaccaaagtggataaaaaagtggaaccgaaaagctgcgataaaacccatacctgcccgccgtgcccggcgccggaactgctgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccatgaagatccggaagtgaaatttaactggtatgtggatggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtataacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaagcgctgccggcgccgattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgcgatgaactgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcaaa；
135.编码第二抗体轻链恒定区的多核苷酸序列seq id no.16为：
136.ggccagccgaaagcggcgccgagcgtgaccctgtttccgccgagcagcgaagaactgcaggcgaacaaagcgaccctggtgtgcctgattagcgatttttatccgggcgcggtgaccgtggcgtggaaagcggatagcagcccggtgaaagcgggcgtggaaaccaccaccccgagcaaacagagcaacaacaaatatgcggcgagcagctatctgagcctgaccccggaacagtggaaaagccatcgcagctatagctgccaggtgacccatgaaggcagcaccgtggaaaaaaccgtggcgccgaccgaatgcagc。
137.用于检测γ干扰素的抗体组合的重链和轻链的多核苷酸的表达系统，表达系统为哺乳动物表达载体。
138.γ干扰素(ifn-γ)的抗原表达系统为expi 293表达系统。
139.抗体表达系统为cho表达系统。
140.含有上述表达系统的宿主细胞。
141.用于检测γ干扰素的抗体组合在制备用于体外定量检测γ干扰素含量的生物制品中的应用。
142.体外定量检测是指检测血清、血浆、全血和/或末梢血中γ干扰素的含量。
143.生物制品为试剂盒。
144.试剂盒为双抗体夹心法检测试剂盒。实施例2
145.第一抗体和第二抗体，均是采用噬菌体展示的方法筛选得到的，再以nhs-biotin试剂标记纯化好的蛋白，γ干扰素(ifn-γ)抗原是采用expi293表达系统表达的，其表达序列如seqidno.17所示或为与seqidno.17序列同源性大于90％的氨基酸序列。
146.seqidno.17序列：
147.qdpyvkeaenlkkyfnaghsdvadngtlflgilknwkeesdrkimqsqivsfyfklfknfkddqsiqksvetikedmnvkffnsnkkkrddfekltnysvtdlnvqrkaiheliqvmaelspaaktgkrkrsqmlfrgrrasq。
148.γ干扰素(ifn-γ)抗原的核苷酸序列如seqidno.18所示或为与seqidno.18序列同源性大于90％的核苷酸序列。
149.seqidno.18序列：
150.caggatccgtatgtgaaagaagcggaaaacctgaaaaaatattttaacgcgggccatagcgatgtggcggataacggcaccctgtttctgggcattctgaaaaactggaaagaagaaagcgatcgcaaaattatgcagagccagattgtgagcttttattttaaactgtttaaaaactttaaagatgatcagagcattcagaaaagcgtggaaaccattaaagaagatatgaacgtgaaattttttaacagcaacaaaaaaaaacgcgatgattttgaaaaactgaccaactatagcgtgaccgatctgaacgtgcagcgcaaagcgattcatgaactgattcaggtgatggcggaactgagcccggcggcgaaaaccggcaaacgcaaacgcagccagatgctgtttcgcggccgccgcgcgagccag。实施例3
151.含有2种抗体的试剂盒的具体组成以及各组成的具体浓度如表1所示。
152.表1表1
153.试剂如下所示：
154.(1)elisa实验包被缓冲液(ph9.60.05m碳酸盐缓冲液)：
155.nahco31.59克，
156.nahco32.93克，
157.加蒸馏水至1000ml；
158.(2)elisa实验洗涤缓冲液(ph7.4pbs)：0.15m
159.kh2po40.2克，
160.na2hpo4·
12h2o2.9克，
161.nacl8.0克，
162.kcl0.2克，
163.tween-200.05％0.5ml，
164.加蒸馏水至1000ml；
165.(3)elisa样本稀释液：
166.牛血清白蛋白(bsa)0.1克，
167.加洗涤缓冲液至100ml；
168.(4)elisa实验终止液(2mh2so4)：
169.蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml；
170.(5)elisa底物缓冲液(ph5.0磷酸氢二钠柠檬酸)：
171.0.2mna2hpo4(28.4克/l)25.7ml，
172.0.1m柠檬酸(19.2克/l)24.3ml，
173.加蒸馏水50ml；
174.(6)elisa实验tmb(四甲基联苯胺)使用液：
175.tmb(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，
176.底物缓冲液(ph5.5)10ml，
177.0.75％h2o232μl；
178.(7)elisa实验封闭液：
179.牛血清白蛋白(bsa)5克，
180.加洗涤缓冲液至100ml。实施例4
181.1、含有2种抗体的试剂盒用于γ干扰素检测的具体操作过程如下所示。
182.步骤：1)抗体预包被：用包被缓冲液稀释29g2抗体至浓度为1μg/ml，100μl每孔加入酶标板中，4℃过夜；2)封闭：每孔加入100μl的封闭液，37℃封闭0.5-1小时，用洗涤缓冲液洗板3次，每次30s，拍干；3)标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔和空白对照孔16孔，用样本稀释液梯度稀释hifn-γ抗原，每个浓度200μl，浓度分别为500pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.6pg/ml、7.8pg/ml、3.9pg/ml，每个浓度两个复孔，各孔加样量都为100μl，空白孔每孔各加100μl样本稀释液；4)待测样本的稀释与加样：将样本稀释液240μl，然后再加待测样品60μl(样品最终稀释度为5倍)，共三个复孔，每孔100μl将样品加于酶标板孔底部；5)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，用洗涤缓冲液洗板3次，每次30s，拍干；6)生物素标记抗体孵育：于各反应孔中，加入新鲜稀释的生物素标记抗体，每孔100μl，37℃，0.5-1h，用洗涤缓冲液洗板3次，每次30s，拍干；7)显色：每孔先加入tmb显色剂各50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；8)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；9)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。
183.2、样本要求：
184.用无菌管收集血清，室温血液自然凝固10-20分钟，2-8℃条件离心20分钟左右
(2000-3000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
185.含有抗体组合的试剂盒，在用于体外定量检测人血清、血浆、全血、末梢血中γ干扰素(ifn-γ)的含量的结果判定标准如下表2所示。
186.表2ifn-γ(ng/ml)临床应用建议＜0.003表观健康人群的95％位点的参考值0.003-0.060正常，或存在轻微炎症、轻微感染0.060-0.100提示有一般细菌感染或全身性炎症反应＞0.100提示可能是脓毒症
187.本发明试剂盒的标准曲线如图1所示。实施例5
188.以市售的ifn-γ检测试剂盒做为对比产品1，与本发明实施例4提供的试剂盒分别对样本进行了检测。
189.市售ifn-γ检测试剂盒为：
190.对比产品1：
191.产品名称：human ifn-γelisa kit(人干扰素-γ酶联免疫吸附检测试剂盒)；
192.产品货号：pi511；
193.产品规格：96t；
194.购自上海碧云天生物技术有限公司。
195.检测过程中，先对试剂盒的基本特征进行了对比，具体如下表3所示。
196.表3表3
197.从表3可以看出，各试剂盒的基本特征已经存在了差别，实施例4、对比产品1所针对的样本均为人血清中的γ干扰素(ifn-γ)；但实施例4的包被抗体和检测抗体与对比产品1完全不同，在此前提下，实施例4所提供试剂盒的检测灵敏度大大超过了对比产品1，检测范围也更大。实施例4试剂盒实际上已经达到了同类产品所能达到的最高灵敏度。
198.进一步的，以血液样本进行了ifn-γ检测，检测方法具体为：收集炎症或者感染患者和正常人血清样本各10例，分别用本专利实施例4的试剂盒及市售的ifn-γ检测试剂盒(对比产品1)进行了ifn-γ检测，结果具体如下表4所示，表4中h组为健康机体血清，p组为
炎症或感染机体血清。
199.表4表4
200.综合表2的判定标准，可以确定若血清ifn-γ浓度》3pg/ml，表明可能存在炎症或其他感染，在上述表4的检测数据对比中，可以看出，市售试剂盒(对比产品1)在针对h1、p4、p7、p8的检测中，均出现了由于灵敏度低从而漏检或误检的情况，漏检(误检)率达到了20％，已属于漏检率较高水平；而相对的本发明试剂盒检测结果则为未出现漏检/误检，也即是漏检/误检率为0，说明了本发明含有抗体组合的试剂盒，其灵敏度要远高于现有产品。实施例6
201.本发明提供了用于检测人源血清样本中γ干扰素的两种抗体，即第一抗体29g2和
第二抗体25b6，并将其组合后采用双抗体夹心法进行检测，但实际上，以噬菌体展示的方法筛选得到的上述两种抗体，单独使用以及调换使用时，也同样具备检测人源血清样本中γ干扰素的功能，为验证其单独使用及调换使用时的效果，申请人采用实施例1-5相似的方法进行了检测(单抗是采用了常规方法检测，双抗是采用夹心方法检测)，并将结果进行了对比，具体如下。
202.单独第一抗体29g2、单独第二抗体25b6、抗体组合29g2(包被)+25b6(检测)、抗体组合25b6(包被)+29g2(检测)组成试剂盒的基本特征比较结果如表5所示。
203.表5 29g2单独25b6单独25b6+29g229g2+25b6(实施例4)抗原人ifn-γ人ifn-γ人ifn-γ人ifn-γ包被抗体——25b6(第二抗体)29g2(第一抗体)检测抗体29g2(第一抗体)25b6(第二抗体)29g2(第一抗体)25b6(第二抗体)方法elisaelisaelisaelisa灵敏度6.0pg/ml6.0pg/ml3.5pg/ml2.8pg/ml检测范围20pg/ml-500pg/ml20pg/ml-500pg/ml10pg/ml-500pg/ml10pg/ml-500pg/ml
204.从表5可以看出，单独使用第一抗体29g2和单独使用第二抗体25b6均能够有效的对人源血清样本γ干扰素进行检测，且二者单独使用时的检测灵敏度和检测范围也要优于现有市售产品(表3中对比产品1)，而将第一抗体第二抗体调换的抗体组合25b6(包被)+29g2(检测)，其效果要更优于第一抗体和第二抗体的单独使用，更进一步的是，采用本发明所记载的抗体组合29g2+25b6，其检测灵敏度和检测范围是所有选择里面最好的，不仅优于现有产品，也同样更优于单独使用和调换使用的方式。
205.为了测试实际的使用效果，申请人也进行了随机的人源血液样本进行了ifn-γ检测，检测方法与得出表4结论的检测方法相似，其具体结果如表6所示。
206.表6
207.同样综合表2的判定标准，可以确定若血清ifn-γ浓度》3pg/ml，表明可能存在炎症或其他感染，在上述表6的检测数据对比中，可以看出，抗体组合29g2+25b6试剂盒的检测结果未出现漏检，也即是漏检率为0，抗体组合25b6+29g2试剂盒在h3、p4的检测中出现了漏/误检，也即是漏/误检率为10％；单独使用第二抗体25b6在针对h9、p5的检测中，出现了漏/误检，漏/误检率为10％；单独使用第一抗体29g2在针对h3、h4、p8的检测中，出现了漏/误检，漏/误检率为15％；由此对比结果可以说明，单独使用第一抗体和第二抗体，其检测灵敏度要比抗体组合使用略低。
208.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。