一种抗5-羟甲基糠醛半抗原、完全抗原和抗体及制备方法与流程

发明属于免疫化学，具体涉及一种抗5-羟甲基糠醛半抗原、完全抗原和抗体及制备方法。

背景技术：

1、5-羟甲基糠醛，为无色针状结晶，具有甘菊花味，是由葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的一种含有呋喃环的小分子化合物，是中药材及中药复方中常见的成分之一，也广泛存在于葡萄干、乳制品、蜂蜜、蛋糕等食品中。研究表明，5-羟甲基糠醛对眼、黏膜、皮肤有刺激性，具有神经毒性、遗传毒性，在体内可经过代谢转化为5-亚磺酰甲基糠醛，具有较强致癌性和基因毒性，所以其是一种具有潜在安全隐患的药品内源性污染物。

2、对于葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液，chp、bp和usp均采用紫外分光光度法在284nm测定吸收度的方法控制产品中5-羟甲基糠醛量，浓度不同，吸收度的限度不同；随着检测技术的发展和药品质量要求的提高，采用高效液相色谱法等选择性更好、灵敏度更高的检测手段已经成为未来的趋势。

3、国外有些企业标准对用到葡萄糖等单糖的口服制剂也进行了5-羟甲基糠醛的限度控制，我国药典对蜂蜜及某些含蜂蜜制剂也进行5-羟甲基糠醛的限度控制。但仪器检测普遍操作繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，所以发展一种简单、快速、灵敏的分析技术是十分必要的。而免疫分析技术正是一种快速、灵敏、操作简单、费用低的检测技术。其基本原理认为：抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德华引力作用等诸多因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可体内进行，也可体外进行，这些特点使其能被利用建立免疫分析方法，可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度。所以，免疫分析为5-羟甲基糠醛残留研究提供了一条新的分析检测途径。

技术实现思路

1、发明的目的在于提供一种抗5-羟甲基糠醛半抗原、完全抗原和抗体及制备方法，以解决上述背景技术中提出现有的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种抗5-羟甲基糠醛半抗原的化学式如式ⅰ，一种抗5-羟甲基糠醛半抗原为起始原料，其分子量为226；

3、

4、式ⅰ所示的化合物的制备方法，包括如下步骤：

5、(1)取5-羟甲基糠醛1260mg，丁二酸酐1200mg，用20ml吡啶溶解，置于60度条件下搅拌反应8小时；

6、(2)旋干吡啶后，加入20ml的稀盐酸，再用乙酸乙酯萃取，合并有机相；

7、(3)用饱和食盐水洗涤2次，最后无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯即可获得如式ⅰ的抗5-羟甲基糠醛半抗原。

8、一种抗5-羟甲基糠醛完全抗原，化学式如式ⅱ；

9、

10、所述5-羟甲基糠醛完全抗原为抗5-羟甲基糠醛半抗原中羧基与载体蛋白中的氨基发生化学反应形成酰胺键连接的偶联物；

11、优选的，载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白和卵清白蛋白中的至少一种。

12、优选的，一种抗5-羟甲基糠醛完全抗原分为免疫原和包被原；免疫原的获取包含以下步骤：

13、(1)取半抗原活化酯3mg，加入到溶有5mg血蓝蛋白的pbs(0.01mol/l，ph＝7.4)溶液中，与4度条件下反应过夜；

14、(2)然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/lpbs溶液充分透析，得到免疫原；

15、包被原的获取包含以下步骤：

16、(1)取半抗原活化酯12mg，加入到溶有100mgbsa的pbs(0.01mol/l，ph＝7.4)溶液中，与4度条件下反应过夜；

17、(2)然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/lpbs溶液充分透析，得到包被原。

18、优选的，半抗原活化酯合成包含以下步骤：

19、(1)在5ml的玻璃瓶中，取半抗原23mg，用0.5ml的n,n-二甲基甲酰胺溶解配制成a液；

20、(2)分别称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐20mg，n-羟基丁二酰亚胺12mg，两者混合一起用0.5ml的n,n-二甲基甲酰胺溶解配制成b液；

21、(3)冰浴条件下b液逐滴加入a液中，然后室温搅拌过夜，终止反应后即得半抗原活化酯；

22、一种抗5-羟甲基糠醛抗体的制备方法，包括以下步骤：

23、(1)选取8周龄左右的雌性balb/c小鼠作为免疫动物进行免疫，分别将小鼠编号为1号、2号、3号、4号，免疫采取颈背部皮下多点注射法；

24、(2)免疫程序：是通过第2次免疫和第3次免疫后测定抗血清的效价和抑制率，具体为：1)初次免疫：为提高抗原的免疫性，采用由弗氏完全佐剂乳化的免疫原，相同体积的免疫原和弗氏完全佐剂混合进行乳化，剂量为.1mg；2)加强免疫：初次免疫后第21天和42天进行加强免疫，剂量为0.1mg，乳化方法相同，以后每隔21天加强免疫一次，共免疫3次，从第2次加强免疫开始，每次免疫10天后对动物试采血进行血清效价测定和特异性测定；

25、(2)抗体制备：选取加强免疫后效价高且特异性强的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，7天后对培养的细胞进行筛选，找到达到要求的细胞孔，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，对其进行亚克隆，最终获得单一的细胞株，扩大培养；

26、(3)将扩大培养的杂交瘤细胞注入已提前注射石蜡的小鼠体内，7天左右，抽取小鼠腹腔积液，对其进行蛋白提纯既可获得想要的目标抗体。

27、血清效价检测方法包含以下步骤：

28、(1)将制备好的5-羟甲基糠醛包被原溶于ph9.6 na2co3-nahco3的缓冲液中，将5-羟甲基糠醛包被原稀释为1.0μg/ml作为包被液，96孔微孔板每孔各加入100μl，4℃放置过夜或者37℃恒温温育2～3小时，用pbst即磷酸盐缓冲液0.05％(v/v)，tween20洗液洗涤1次；

29、(2)每孔加入200μl1％牛血清蛋白(bsa)/pbs封闭液，封闭2小时，用洗液洗涤1次；

30、(3)加抗血清及标准品：将抗血清梯度稀释；将5-羟甲基糠醛标准品溶于适量dmf配制成1.0mg/ml的标准品溶液，4℃保存备用。效价列：每孔加50ul的空白稀释液和50ul梯度稀释的抗血清，最后两孔加一抗稀释液作空白对照；抑制列：每孔加50ul的标准品溶液和50ul梯度稀释的抗血清，最后两孔加标准品稀释液作空白对照，37℃温育30min；

31、(4)用洗液洗微孔板2次，将孔内液体甩掉，微孔板脱水仪甩干，向每微孔加100微升羊抗鼠酶标二抗，37℃反应30分钟；

32、(5)用洗液洗微孔板3次，将孔内液体甩掉，微孔板脱水仪甩干，加入底物a和底物b的混合液，该底物a和底物b的混合液的配比为100：1，室温下反应0.25小时；

33、(6)读数测定：450nm波长下测吸光值；选择吸光度值在1.5～2.0区间内的抗血清稀释倍数为抗血清效价，抗血清的效果由其抑制率得出。

34、与现有技术相比，发明的有益效果是：

35、(1)本发明是通过实验设计合成了最大限度保留5-羟甲基糠醛结构的半抗原，并突出了其特异性结构，获得的单克隆抗体的特异性较强。