一种纤连蛋白突变体及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种纤连蛋白突变体及其应用。


背景技术：

2.纤连蛋白是一种细胞外基质（ecm）的粘附分子，其广泛存在于血液、体液及各类组织中的高分子糖蛋白。分子量为450kda，由两个220kda的亚基通过二硫键连接形成。亚基有6个致密球状体构成，每个区域都有特定的功能可以与特殊的配体结合，具有多种生物学功能。fn中至少存在两个独立于细胞附着区域，其一是在fn中心位置，具有两个协同作用的氨基酸序列arg-gly-asp（rgd）和pro-his-arg-asn（phrsn），另一个在羧基端附近，iiics交替拼接，关键小序列是leu-asp-val（ldv）和arg-glu-asp-val（redv）。rgd是α5β1、αvβ3、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α8β1整合素的常见结合位点。有研究表明，当细胞同时存在αvβ1与α5β1时，才能够促进细胞增殖。fn基因位于2号染色体上75kb左右，拥有50个左右的外显子，基因序列的90%以上都是通过fni型ii型iii型重复排列组成。它的主要结构和排列方式从（n-c）端依次为：
①
6个fni
②
2个fnii
③
3个fni
④
14个fniii
⑤
v区（iiics区）
⑥
1个fniii
⑦
3个fni。
3.纤连蛋白是细胞外基质的重要组成部分，通过与细胞表面受体及细胞外基质分子的相互作用，促进细胞粘附、迁移，促进创伤修复，因此，纤连蛋白在医学、美容、护肤领域有广泛的应用前景。虽然动物组织、血液中含有纤连蛋白，但是含量极为有限，因此，组织来源的纤连蛋白存在产量低，成本高，产品纯度低的缺点。重组dna技术通过构建线路蛋白基因的表达载体，在原核或者真核生物中表达、制备高纯度的纤连蛋白。纤连蛋白单体约220~250kda，分子量较大，研究表明，通过选择纤连蛋白上的部分结构域，重组dna技术制备含有纤连蛋白部分结构域的突变体，具有纤连蛋白的生物学活性。但是，如何筛选纤连蛋白的活性结构域进行重构，获得高活性、高稳定性的纤连蛋白突变体是制约纤连蛋白应用的关键技术之一。此外，重组蛋白异源表达时，往往表达量低，或者以包涵体形式表达，这也是制约纤连蛋白应用的另一关键技术。


技术实现要素：

4.针对现有技术不足，本发明提供一种纤连蛋白突变体及其应用来解决上述技术问题。
5.为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：一种纤连蛋白突变体，其特征在于，所述纤连蛋白突变体的核苷酸序列如seq id no .1。
6.优选的，所述纤连蛋白突变体为选取纤连蛋白与细胞增殖、迁移活性密切相关的结构域，构建纤连蛋白突变体d89，并对纤连蛋白突变体d89的核苷酸进行两步优化来获得。
7.优选的，所述两步优化的方式为结合大肠杆菌密码子偏好性对纤连蛋白突变体d89的核苷酸序列进行初步优化，同时通过翻译暂停理论对纤连蛋白突变体的核苷酸序列
做进一步的优化。
8.优选的，采用所述纤连蛋白突变体制备重组纤连蛋白d89在促细胞增殖、迁移、粘附活性中的应用。
9.优选的，所述重组纤连蛋白d89的制备方式为将纤连蛋白突变体结合表达载体构建成重组载体，再将重组载体转化到宿主细胞中进行表达、纯化。
10.优选的，所述表达载体为质粒pet-28系列载体，所述宿主细胞为大肠杆菌。
11.优选的，所述应用为在制备促进细胞迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等产品中的应用。
12.本发明提供一种纤连蛋白突变体及其应用，与现有技术相比优点在于：（1）本发明通过选取纤连蛋白与细胞增殖、迁移活性密切相关的结构域，构建纤连蛋白突变体d89，并对纤连蛋白突变体d89进行优化，有效提升优化后的纤连蛋白突变体d8的稳定性，同时便于后续的优化后的纤连蛋白突变体d8在核糖体上的翻译过程中的折叠，保证重组纤连蛋白d89的稳定制备。
13.（2）本发明制备的重组纤连蛋白d89具有良好的稳定性同时有效促进促进细胞增殖和迁移的活性，便于后续对相应药物开发，对本领域实验研究提供良好的导向。
附图说明
14.图1为d89重组纤连蛋白的表达电泳图；图2为d89重组纤连蛋白的温度优化电泳图；图3为d89重组纤连蛋白的iptg诱导剂浓度的优化电泳图；图4中a为pet-28a/d89工程菌摇瓶发酵生长曲线；b为pet-28a/d89工程菌摇瓶发酵诱导时间选择电泳图；图5中a为目的蛋白d89ni-nta分离纯化亲和层析图谱；b为目的蛋白d89ni-nta分离纯化sds-page电泳图；图6为不同浓度的d89重组纤连蛋白促细胞增殖率柱状分析图；图7为不同浓度的d89重组纤连蛋白促细胞粘附率柱状分析图；图8为不同浓度的d89重组纤连蛋白在不同时间对细胞迁移的显微镜照片；图9为不同浓度的d89重组纤连蛋白在不同时间对细胞迁移率的柱状分析图。
具体实施方式
15.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
16.实施例中涉及的主要材料：1、宿主菌大肠杆菌bl21（de3）（merck）；2、质粒pet-28a（merck）；3、预染蛋白marker（购自fermentas公司）；4、ni sepharose 6 fast flow（购自ge公司）；
5、cck-8试剂盒（购自美国日本同仁公司）；6、其它试剂均为分析纯试剂：平衡缓冲液（1
×
pbs、ph7.4+20mmol/l咪唑），洗杂缓冲液（1
×
pbs、ph7.4+50mmol/l咪唑），洗脱缓冲液（1
×
pbs、ph7.4+300mmol/l咪唑）。
17.实施例1：选取纤连蛋白与细胞增殖、迁移活性密切相关的结构域，构建纤连蛋白突变体d89，其具体的核苷酸序列如下：atggctgttcctcctcccactgacctgcgattcaccaacattggtccagacaccatgcgtgtcacctgggctccacccccatccattgatttaaccaacttcctggtgcgttactcacctgtgaaaaatgaggaagatgttgcagagttgtcaatttctccttcagacaatgcagtggtcttaacaaatctcctgcctggtacagaatatgtagtgagtgtctccagtgtctacgaacaacatgagagcacacctcttagaggaagacagaaaacaggtcttgattccccaactggcattgacttttctgatattactgccaactcttttactgtgcactggattgctcctcgagccaccatcactggctacaggatccgccatcatcccgagcacttcagtgggagacctcgagaagatcgggtgccccactctcggaattccatcaccctcaccaacctcactccaggcacagagtatgtggtcagcatcgttgctcttaatggcagagaggaaagtcccttattgattggccaacaatcaacagtttctgattaa 对上述纤连蛋白突变体d89，结合大肠杆菌密码子偏好性对纤连蛋白突变体的核苷酸序列进行初步优化，同时通过翻译暂停理论对纤连蛋白突变体的核苷酸序列做进一步的优化，获得优化后的纤连蛋白突变体d89，具体的核苷酸序列如下： atggcggtacctcctccgactgatctgcgttttaccaatattggtccggataccatgcgtgtaacttgggcaccgccaccatccatcgacctgaccaacttcctggttcgttattctccggtgaaaaatgaagaagacgttgcagaactgtccatctctccgagcgataacgctgttgtgctgaccaacctgctgccaggtaccgaatacgtggtttccgtgagcagcgtctacgagcagcatgaatctacgccgctgcgtggtcgtcagaaaaccggtctggactccccgaccggtatcgacttctccgatatcactgctaactctttcactgtgcattggatcgctccgcgtgctaccattactggttatcgtatccgccaccatccggaacacttctctggtcgtccgcgtgaagaccgtgttccacacagccgtaactctatcacgctgactaatctgacccctggcaccgaatatgtggtttctatcgttgctctgaacggccgcgaagaatctccgctgctaataggacagcagaggactgtctccgactaa。
18.实施例2： d89重组纤连蛋白的表达、优化、纯化：1、纤连蛋白表达工程菌的筛选：将上述实施例1中优化后的纤连蛋白突变体d89与质粒pet-28a（merck）构建成纤连蛋白表达质粒pet-28a-d89，并转化大肠杆菌感受态细胞bl21，含有50μg/ml卡那霉素、lb固体培养基平板筛选阳性克隆。
19.挑取阳性克隆到含有10ml的lb液体培养基中，待od600=0.8时，加入1mm的iptg诱导表达，sds-page电泳鉴定蛋白的表达情况，选择表达量高的工程菌进行保种。
[0020] 2、纤连蛋白诱导表达和可溶性分析将步骤1得到的表达菌株pet-28a-d89接种到50ml含50
µ
g/ml卡那霉素含量的lb培养基中，37℃、220rpm培养，当od600=0.8时，加iptg，终浓度为1mm，37℃诱导表达6h后，5000
×
g、4℃离心10min收集菌体。菌体用平衡缓冲液重悬，高压（900bar）均质破碎细胞，18000
×
g、4℃离心30min，上清和沉淀分别留样待后续的sds-page电泳（5%浓缩胶、12%分离胶）及western blot分析，结果如图1所示。
[0021] 3、纤连蛋白的摇瓶优化分析3.1诱导温度优化（1）纤连蛋白表达质粒转入bl21(de3)大肠杆菌表达宿主中，挑取平板上生长的单菌落接种到10ml的lb/kan培养基中，在37℃、220rpm振荡活化过夜。
[0022]
（2）将工程菌取5%接种于含有200ml的lb/kan培养基中，在37℃、220rpm下振荡培养至菌体生长对数中期，生物量达到od600=0.6-0.8时取出1.5ml到ep管中，并标记好放在4℃备用。
[0023]
（3）将其余的菌液加入1mm的iptg分别置于16℃、25℃、37℃下振荡培养6h。
[0024] （4）将诱导完成的菌液取出200ul放入分光光度计中测量od600并记录，然后将菌液保存成一份全菌样品，一份为破菌样本。在离心机中9000rpm、5min，弃掉上清用1
×
pbs缓冲液洗涤一次，离心之后用1
×
pbs缓冲液重悬菌体，所有样品均如此操作。
[0025]
（5）将破菌的样品放置于4℃冰上，使用超声破碎仪（10%功率，破碎5min，破碎5s，暂停5s，至菌液澄清透明能透光）进行小样破碎（大量样品使用均质机），完成后10000rpm，4℃，离心10min。上清用新的ep管放置，沉淀用1
×
pbs缓冲液重悬。
[0026]
（6）将各组样品用loading buffer混匀放置于100℃的制样机上处理10min，将这些样品进行sds-page蛋白电泳。将电泳后的凝胶进行考马斯亮蓝染色经过脱色液褪去背景之后比较，结果如图2所示。
[0027]
3.2诱导剂iptg浓度优化（1）同3.1（1）（2）同3.1（2）（3）将其余的菌液分别加入0.1mm、0.25mm、0.5mm、0.75mm、1mm的iptg分别置于37℃下振荡培养6h。
[0028]
（4）将诱导完成的菌液取出200ul放入分光光度计中测量od600并记录，然后将菌液保存。在离心机中9000rpm、5min，弃掉上清用1
×
pbs缓冲液洗涤一次，离心之后用1
×
pbs缓冲液重悬菌体，所有样品均如此操作。
[0029]
（5）将破菌的样品放置于4℃冰上，使用超声破碎仪进行小样破碎（大量样品使用均质机），完成后10000rpm，4℃，离心10min。上清用新的ep管放置。
[0030]
（6）将各组样品用loading buffer混匀放置于100℃的制样机上处理10min，将这些样品进行sds-page蛋白电泳；将电泳后的凝胶进行考马斯亮蓝染色经过脱色液褪去背景之后比较，结果如图3所示。
[0031]
3.3诱导时间优化（1）同3.1（1）（2）同3.1（2）（3）将其余的菌液加入0.1mm的iptg分别置于37℃下振荡培养6h，然后在1~6h分别取1ml菌液于4℃保存备用。
[0032]
（4）将每个小时收取的菌液在离心机中9000rpm、5min，弃掉上清用1
×
pbs缓冲液洗涤一次，离心之后用1
×
pbs缓冲液重悬菌体，所有样品均如此操作。
[0033]
（5）将破菌的样品放置于4℃冰上，使用超声破碎仪进行小样破碎（大量样品使用均质机），完成后10000rpm，4℃，离心10min，上清用新的ep管放置。
[0034]
（6）将各组样品用loading buffer混匀放置于100℃的制样机上处理10min，将这些样品进行sds-page蛋白电泳，将电泳后的凝胶进行考马斯亮蓝染色经过脱色液褪去背景之后比较，结果如图4所示。
[0035]
4、d89纤连蛋白的纯化按照步骤2中的方法获得菌体后，将菌体按质量/体积比1∶10（g/v）比例重新悬于平衡缓冲液中，高压（900bar）均质破碎细胞，4℃、25000
×
g、30min离心收集上清。
[0036]
上清经ni-nta亲和层析纯化，柱体积10ml，流速1.5ml/min，平衡缓冲液洗回基线，洗杂缓冲液洗杂蛋白，洗脱缓冲液洗脱目的蛋白；纯化后的纤连蛋白经sephadexg-25分子筛脱咪唑以及3kda的超滤管浓缩，sds-page电泳鉴定纯化的纤连蛋白的纯度，结果如图5所示。
[0037]
实施例3：d89重组纤连蛋白促细胞增殖活性测定：（1）balb/c 3t3细胞接种于96孔细胞培养板中（3000个细胞/孔），37℃，5%的co2细胞培养箱培养24h。
[0038]
（2）换用dmem无血清培养基继续培养2h。
[0039]
（3）分别加待检测样品以及pbs（阴性对照组），继续培养24h。
[0040]
（4）每孔加入10
µ
l的cck-8试剂，37℃，5% 的co2细胞培养箱孵育1.5h后取出。
[0041]
（5）用酶标仪读取96孔板在450nm和630nm的吸光值，以630nm为参比波长，在450nm处测定吸光度，记录测定结果。相对促细胞增殖率=（实验组450nm吸光值-阴性对照组450nm吸光值）/阴性对照组450nm吸光值
×
100%。
[0042]
结果如图6所示，图中在d89重组纤连蛋白浓度在0.625ug/ml时其增殖率最高，且在d89重组纤连蛋白浓度高于或低于这一标值时，其增殖率明显降低。
[0043]
实施例4：d89重组纤连蛋白促细胞粘附活性测定：（1）取96孔板，将配置好的不同fn浓度的蛋白液加入到孔板中，放置在4℃过夜孵育。
[0044]
（2）将蛋白液吸出，加入配置好的1х104cells/孔的细胞悬液，每孔100ul，放置到培养箱中培养1.5h。
[0045]
（3）用1
×
pbs吹打细胞使得没有粘附在孔板中的细胞被吹打下来，吸出pbs，加入100ul/孔的dmem培养基并加入10ul/孔的cck8试剂，避光37℃孵育2h。
[0046]
（4）取出96孔培养板放入酶标仪测量450nm和630nm的吸收光波长。
[0047]
（5）将数据进行处理（值：450nm-630nm），然后粘附率=【fn不同浓度处理的值-未加入fn处理的值】/未加入fn处理的值
×
100%。
[0048]
结果见图7，如图所示d89重组纤连蛋白促细胞粘附率在浓度为40ug/ml时，最高达到6%以上。
[0049]
实施例5：d89重组纤连蛋白促细胞迁移活性测定：（1）将培养好的细胞进行细胞计数和活率测定，所有使用的细胞活率要在90%以上，按照1х106cells/孔将细胞种于6孔板中，每组三个复孔。加入细胞悬液之前需要在孔
板底部进行划线以确保后续实验拍照的顺利，然后加入细胞悬液2ml/孔。沿着孔板内壁加入以确保细胞在孔板中均匀分布，放入细胞培养箱中过夜培养24h。
[0050]
（2）次日，取出培养板吸出培养基，用1
×
pbs清洗平板，确保细胞不要飘起来。然后加入2ml/孔的无血清dmem培养基，饥饿处理2h。
[0051]
（3）饥饿完成后吸掉培养基用200ul枪头和直尺在平板中对细胞进行划痕。划痕时保证枪头笔直，每孔两条划痕线，然后用1
×
pbs清洗平板，洗去划痕掉落的细胞。
[0052]
（4）对照组用1%fbs的dmem培养基，实验组用不同浓度的fn的1%fbs的dmem培养基。完成后立即用显微镜进行拍照，然后放回培养箱中继续培养6h显微镜拍照、12h显微镜拍照、24h显微镜拍照，结果如图8所示。
[0053]
（5）用image j进行划痕面积统计，同时，计算划痕愈合率=【0h划痕面积-其他时间点划痕面积】/0h划痕面积
×
100%。
[0054]
结果见图9，由图可知在培养6-24h的过程中，随着时间的增加细胞迁移率逐步上升，且在d89重组纤连蛋白的浓度为10ug/ml，培养时间为24h时，细胞迁移率最高达到60%以上。
[0055]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0056]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。