一种慢病毒质粒载体及稳定表达tRNA2_LeuTAA的细胞系的制备方法与应用

本发明涉及生物，具体涉及一种慢病毒质粒载体及稳定表达trna2_leutaa的细胞系的制备方法与应用。

背景技术：

1、目前的医学或者生物学研究中，研究人员已经实现通过人工设计和改造，合成大量自然界不存在或未发现的生物元件、生物装置及生物系统，为探索细胞内基因调控机制提供了有效的工具。

2、trna是一种典型的非编码rna，长度约为60-90个核苷酸。成熟trna具有典型的三叶草型二级机构，由接收臂、d环、反密码环、可变臂和tψc环构成。在细胞内trna通过反密码子依次识别mrna密码子，将氨基酸递呈至延伸中的肽链。以往研究中仅认为trna是普遍表达的管家分子，但随着研究深入，发现trna具有组织、细胞特异的表达模式。trna异常表达可能导致疾病的发生发展，包括神经类疾病和肿瘤。在肿瘤中，trna可通过密码子偏好性调控rna稳定型和翻译而调控肿瘤细胞的生物学行为；或与细胞色素c结合调控凋亡过程；或激活蛋白翻译等。但是trna是否具有其它调控机制尚需探索。

3、trna2_leutaa来源于线粒体基因，长度为78nt，文献报道及生物信息学分析发现其5’具有生成tsrna潜能。trna2_leutaa在前列腺组织中表达明显上调，但其在前列腺癌中的具体生物学功能及作用机制尚未有报道。本发明着手构建稳定过表达trna2_leutaa的前列腺癌细胞株，为探索trna2.leu在前列腺癌细胞中高表达的生物学作用以及在前列腺发生发展中的作用机制奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种慢病毒质粒载体及稳定表达trna2_leutaa的细胞系的制备方法与应用。

2、为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种慢病毒质粒载体，所述慢病毒质粒载体用于编码trna2_leutaa，所慢病毒质粒载体由骨架载体plvx-puro和插入克隆位点xhoⅰ和bamhⅰ之间的序列组成，其序列如seq id no.1所示。

3、本发明还提供一种慢病毒转移载体，所述慢病毒转移载体的元件包括cmv增强子、cmv启动子、酶切位点、pkg启动子和puro抗性位点。

4、本发明还提供一种慢病毒，所述慢病毒携载上述的慢病毒转移载体，所述慢病毒由慢病毒包装质粒及上述的慢病毒转移载体转染细胞后分离后获得。

5、进一步地，所述慢病毒包装质粒由pspax2和addgene编号为12259的pmd2.g组成。

6、本发明还提供一种表达trna2_leutaa的细胞系，由上述的慢病毒转染所述细胞后得到表达trna2_leutaa的细胞系。

7、进一步地，所述细胞是真核细胞。

8、进一步地，所述真核细胞为哺乳动物细胞。

9、进一步地，所述哺乳动物细胞为pc-3细胞。

10、本发明还提供一种制备上述细胞系的方法，包括以下步骤：

11、1)以pc-3细胞gdna为模板，pcr扩增含酶切位点xhoⅰ和bamhⅰ的trna2_leutaa全长及侧翼序列；将trna2_leutaa全长及侧翼序列克隆至t载体，并行dna测序；酶切拼接克隆至载体plvx-puro，并行dna测序；

12、2)将序列正确的plvx-puro-trna2_leutaa及包装质粒pspax2、pmd2.g共转染293ft细胞48h及72h后，收集并过滤上清，得到plvx-puro-trna2_leutaa慢病毒；

13、3)将病毒液感染的pc-3细胞培养并puro抗性筛选3代后pcr鉴定阳性即为所获得的表达trna2_leutaa的细胞，保种。

14、本发明还提供上述的细胞系在探索trna2_leutaa对前列腺癌细胞的生物学行为影响及分子机制研究中的应用。

15、以下为本发明涉及的序列：

16、seq id no.1(plvx-puro-trna2_leutaa)：

17、actactaagtttgtagtacatatttaacaaatacaatttctttaaaaactactaagtttgtagtacatatttaacaaatacaatttctttaaaatgaaaataattcagaggaatcacaggtttagagtaaatgaaaccacaggtaattggcagtggtaatagggtatggggtgggaagtttgggatgattttggttagcttgagttatccagttgatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttgatctcccgatccgtcgacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctctagctagaggtcgacggtaaacgctagcaatgtcaaggcctctcactctctgatattcatttctttgcaagttataaatactgaataataagatgacatgaactactactgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactacttgaagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagcagtgggttccctagttagccagagagctcccaggctcagatctggaagggttcgtttgttcaatgattaaagtcctacctgatctgaggtcagactggagtaatccagtttggtttctatctatttaacatttctcctagtacaaaaggacaaaatagggcccacttcataaagcaccctcgcctcataaatgatgctatctcaatctaacaaaccatcacacaccctacccaggaacagggtttgttaagatggcagagcctggtaattgcataaaacttaaaattttataatcagaggttcaactcctcttcttaacaatatggctataattaaccttctcctacttattatccccactcttattgctatagcattccttacactcatcgaatgaaaaatcttaggctatacacaactatgcaaaggacccaaaattgtaggtccctatgggctgcttcagccatggatctgagggctcgccactccccagtcccgcccaggccacgcctccctggaaagtccccagcggaaagtcccttgtagcaagctcgatatcagcagttcttgaagtactccggatgcagctctcgggccacgtgatgaaatgctaggcggctgtcaaacctccactctaacacttctctctccgggtcatccatcccatgcaggctcacagggtgtaacaagctggtgttctctcctttattggcctcttctaccttatctggctcaactggtactagcttgtagcaccatccaaaggtcagtggatatctgacccctggccctggtgtgtagttctgctaatcagggaagtagccttgtgtgtggtagatccacagatcaaggatatcttgtcttcgttgggagtgaattagcccttccagtcccctcttttcttttaaaaagtggctaagatctacagctgccttgtaagtcattggtcttaaaggtacctgaggtgtgactggaaaacccacctcctcctcctcttgtgcttctagccaggcacaatcagcattggtagctgctgtattgctacttgtgattgctccatgtttttctaggtctcgactgcagaattaattccaggcggggaggcggcccaaagggagatccgactcgtctgagggcgaaggcgaagacgcggaagaggccgcagagccggcagcaggccgcgggaaggaaggtccgctggattgagggccgaagggacgtagcagaaggacgtcccgcgcagaatccaggtggcaacacaggcgagcagccatggaaaggacgtcagcttccccgacaacaccacggaattgtcagtgcccaacagccgagcccctgtccagcagcgggcaaggcaggcggcgatgagttccgccgtggcaatagggagggggaaagcgaaagtcccggaaaggagctgacaggtggtggcaatgccccaaccagtgggggttgcgtcagcaaacacagtgcacaccacgccacgttgcctgacaacgggccacaactcctcataaagagacagcaaccaggatttatacaaggaggagaaaatgaaagccatacgggaagcaatagcatgatacaaaggcattaaagcagcgtatccacatagcgtaaaaggagcaacatagttaagaataccagtcaatctttcacaaattttgtaatccagaggttgattgttccagacgcgtctaggcaccgggcttgcgggtcatgcaccaggtgcgcggtccttcgggcacctcgacgtcggcggtgacggtgaagccgagccgctcgtagaaggggaggttgcggggcgcggaggtctccaggaaggcgggcaccccggcgcgctcggccgcctccactccggggagcacgacggcgctgcccagacccttgccctggtggtcgggcgagacgccgacggtggccaggaaccacgcgggctccttgggccggtgcggcgccaggaggccttccatctgttgctgcgcggccagccgggaaccgctcaactcggccatgcgcgggccgatctcggcgaacaccgcccccgcttcgacgctctccggcgtggtccagaccgccaccgcggcgccgtcgtccgcgacccacaccttgccgatgtcgagcccgacgcgcgtgaggaagagttcttgcagctcggtgacccgctcgatgtggcggtccgggtcgacggtgtggcgcgtggcggggtagtcggcgaacgcggcggc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18、与现有技术相比，本方案的有益效果：

19、本发明通过构建慢病毒转移载体、包装慢病毒、通过慢病毒感染，puro抗性筛选建立稳定高表达trna2_leutaa的前列腺癌细胞系，并通过pcr验证trna2_leutaa过表达效率，能够为探索trna2.leu在前列腺癌细胞中高表达的生物学作用以及在前列腺发生发展中的作用机制奠定基础。