一种高效生产EPA的裂殖壶菌基因工程菌株、方法和应用

本发明属于基因工程领域和生物化工，尤其是一种高效生产epa的裂殖壶菌基因工程菌株、方法和应用。

背景技术：

1、多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,pufas)在降低心血管疾病方面有重要的作用，通常分为ω-3和ω-6不饱和脂肪酸，其中ω-3不饱和脂肪酸中对人体最重要的两种不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，epa)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，dha)。

2、epa是一种重要的ω-3长链多不饱和脂肪酸，是人体内的必需的微量活性物质，具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激、稳定细胞膜、改善血液循环、降低血液黏度，降低血液中胆固醇的含量等功能，同时对治疗由自身免疫缺陷引起的炎症有效以及能够降低患心血管疾病的风险，是一种重要的保健品原料。目前，大部分epa来源于深海鱼油。

3、裂殖壶菌是属于网粘菌门、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科的一类缺乏叶绿体的海洋单细胞异养型真菌。同时作为一种产油微生物，因其能够高产dha而受到广泛的关注，但是epa的产量比较低，且实现epa和dha的联合生产是一个挑战。

4、迄今为止，已经实现了两种代谢途径用于生产pufas，一种是传统的脂肪酸延长酶/去不饱和酶(el/de)途径，另一种是聚酮合酶(pks)途径。由于pks催化的合成过程可以有效地产生包括epa和dha在内的许多pufas，并且副产物较少，因此被认为是一个比el/de途径更有效的生产pufas的系统。pks途径是大多数海洋产油微生物合成pufas的主要方式，但是这些pks催化结构域的组织方式和产物偏好性明显不同。大多数源自海洋细菌的pks催化结构域分布在四个亚基上，分别为pfaa、pfab、pfac和pfad，然而大多数来源于真核微生物的pks由三个亚基组成，即orfa，orfb和orfc。dha和epa型pks基因簇已经在多种海洋细菌中被鉴定出来，而破囊壶菌中只有dha/n-6dpa型pks基因簇被鉴定出来。

5、通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的公开文献。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种高效生产epa的裂殖壶菌基因工程菌株、方法和应用。

2、本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

3、一种高效生产epa的裂殖壶菌基因工程菌株，所述工程菌株是通过在裂殖壶菌野生型中过表达mete-like结构域中的基因at、ks或at-ks获得的；

4、其中，所述基因at的基因序列为seq id no.13，所述基因ks的基因序列为seq idno.14，所述基因at-ks的基因序列为seq id no.15。

5、进一步地，所述裂殖壶菌野生型为裂殖壶菌hx-308；

6、或者，所述mete-like结构域为来源于裂殖壶菌hx-308的类甲硫氨酸合酶mete-like结构域。

7、如上所述的高效生产epa的裂殖壶菌基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

8、从裂殖壶菌中克隆mete-like结构域中的at、ks基因，在裂殖壶菌中进行过表达获得裂殖壶菌基因工程菌株。

9、进一步地，步骤如下：

10、(1)克隆裂殖壶菌野生型的mete-like结构域中的at、ks基因

11、(2)构建过表达载体pbs-zeo-at,pbs-zeo-ks,pbs-zeo-at-ks

12、1)at、ks和at-ks基因上的拼接及添加同源臂；

13、为at、ks和at-ks基因设计同pbs-zeo酶切位点两端的同源臂序列，将同源臂通过pcr加到at、ks和at-ks基因的两端，胶回收；

14、2)连接反应

15、将酶切后的载体pbs-zeo片段、at基因片段和ks基因片段连接，得到重组过表达载体pbs-zeo-at,pbs-zeo-ks,pbs-zeo-at-ks；

16、3)连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞

17、挑选阳性转化子，提取质粒，测序验证成功，获得过表达载体pbs-zeo-at,pbs-zeo-ks,pbs-zeo-at-ks；

18、(3)构建过表达pbs-zeo-at,pbs-zeo-ks,pbs-zeo-at-ks的裂殖壶菌基因工程菌株

19、1)制备裂殖壶菌感受态细胞；

20、2)裂殖壶菌电转化；

21、3)筛选后，稳定遗传的菌株为重组过表达载体pbs-zeo-at/pbs-zeo-ks/pbs-zeo-at-ks基因的裂殖壶菌基因工程菌株。

22、利用如上所述的裂殖壶菌基因工程菌株高效生产epa的方法，所述方法为将裂殖壶菌基因工程菌株接种于种子培养基活化后，获得发酵用菌种；将发酵用菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养；收集菌体提取脂质，得到epa。

23、进一步地，所述发酵用菌种的具体制备方法包括：

24、将裂殖壶菌基因工程菌株接种于种子培养基中，培养获得一代种子；取所述一代种子接种于种子培养基中，培养获得二代种子；取所述二代种子接种于种子培养基中，培养获得三代种子，作为所述发酵用菌种；

25、其中，所述培养的条件为25～30℃，150～250r/min振摇培养；

26、或者，所述发酵培养的整个周期达到144h，例如可以为48h、60h、72h、84h、96h、120h、或144h。。

27、进一步地，所述收集菌体提取脂质的方法包括：

28、1)向发酵培养结束后的发酵液中加入naoh溶液调ph＝10-13后，加入质量终浓度为0.01-0.5％的破壁酶，40～60℃，100～200r/min振荡5～15h；

29、2)冷却至室温，加入等体积无水乙醇失活破壁酶；

30、3)加入正己烷萃取，收集上层有机相；

31、4)重复步骤3)若干次，合并有机相，挥干溶剂，得到脂质，得到epa。

32、进一步地，将裂殖壶菌基因工程菌株接种于平板培养基，经平板培养后，挑取单菌落接种于种子培养基活化；

33、其中，所述平板培养基的ph值为6.0～6.5，且包括：琼脂15-20g/l，葡萄糖30-60g/l，酵母浸粉8～15g/l，硫酸钠10～15g/l，硫酸镁2～4g/l，硫酸铵6～12g/l，氯化钾1～2g/l，氯化钙0.1～0.2g/l，硫酸钾0.5～1g/l，磷酸二氢钾0.5～2g/l，谷氨酸钠8～12g/l，七水合硫酸锌1～5mg/l，六水合氯化钴0.01～0.1mg/l，五水合硫酸铜2～6mg/l，六水合硫酸镍1～2mg/l，七水合硫酸铁8～15mg/l，泛酸钙2～4mg/l，四水合氯化锰3～5mg/l，二水合钼酸钠0.04mg/l，维生素b6 4-10 mg/l、维生素b12 0.1-1.5mg/l；

34、所述种子培养基的ph值为6.0～6.5，且包括：葡萄糖40-60g/l，酵母浸粉4～6g/l，硫酸钠5～8g/l，硫酸镁2～4g/l，硫酸铵4～8g/l，氯化钾1～2g/l，氯化钙0.1～0.2g/l，硫酸钾0.5～1g/l，磷酸二氢钾0.5～2g/l，谷氨酸钠8～12g/l，七水合硫酸锌1～5mg/l，六水合氯化钴0.01～0.1mg/l，五水合硫酸铜2～6mg/l，六水合硫酸镍1～2mg/l，七水合硫酸铁8～15mg/l，泛酸钙2～4mg/l，四水合氯化锰3～5mg/l，二水合钼酸钠0.04mg/l；

35、所述发酵培养基的ph值为6.0～6.5，且包括：葡萄糖40-60g/l，甘油10-30g/l，酵母浸粉5～15g/l，硫酸钠5～12g/l，硫酸镁2～4g/l，硫酸铵4～8g/l，氯化钾1～2g/l，氯化钙0.1～0.2g/l，硫酸钾0.5～1g/l，磷酸二氢钾0.5～2g/l，谷氨酸钠15～20g/l，七水合硫酸锌1～5mg/l，六水合氯化钴0.01～0.1mg/l，五水合硫酸铜2～6mg/l，六水合硫酸镍1～2mg/l，七水合硫酸铁8～15mg/l，泛酸钙2～4mg/l，四水合氯化锰3～5mg/l，二水合钼酸钠0.04mg/l，维生素b6 4-10 mg/l。

36、如上所述的裂殖壶菌基因工程菌株在epa生产中的应用。

37、如上所述的裂殖壶菌基因工程菌株在同时生产epa和dha中的应用。

38、本发明取得的有益效果是：

39、1、本发明通过在裂殖壶菌野生型中过表达mete-like结构域中的at、ks或at-ks基因获得裂殖壶菌基因工程菌株，可以明显提高epa积累，这为该菌株工业化定向合成epa提供了基础。

40、2、本发明裂殖壶菌基因工程菌株中的at、ks基因克隆于schizochytrium sp.hx-308，该工程菌株对mete-like结构域中的at、ks基因进行过表达，使得裂殖壶菌中的epa含量从1.02％提高到10.6％。

41、3、本发明通过序列比对希瓦氏菌聚酮合酶pfab结构域、裂殖壶菌聚酮合酶orfb结构域和裂殖壶菌类甲硫氨酸合酶结构域(含at和ks结构域)(mete-like)，出现极大的相似性。本发明通过对裂殖壶菌进行转录组分析，发现裂殖壶菌积累epa功能的增强源于类甲硫氨酸合酶mete-like结构域中的at、ks基因转录水平的上调。

42、4、本发明通过发酵培养基中缺乏钴胺素的条件，调控类甲硫氨酸合酶mete-like结构域上调，从而过表达at、ks基因来积累epa。

43、5、本发明采用裂殖壶菌schizochytrium sp.hx-308为出发菌株，通过过表达mete-like结构域中的at、ks基因获得裂殖壶菌基因工程菌株高效生产epa的应用，为产品工业化奠定了理论基础。

44、6、本发明基于启动子策略调控mete-like表达。在培养基中通过钴胺素缺乏的条件高效表达mete-like结构域，通过对裂殖壶菌转录组分析，mete-like结构域中的at、ks基因的转录水平明显上调。

45、7、本发明证实可以通过功能域调控dha型聚酮合酶的功能，使dha型聚酮合酶具有epa合成能力。