一种混合培养包皮获得间充质干细胞的方法及其应用与流程

1.本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其是涉及一种混合培养包皮获得间充质干细胞的方法及其应用。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是存在于多种组织中的多潜能的基质细胞，能够分化为不同类型的细胞，包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞等，间充质干细胞由于其巨大的组织再生潜能、免疫调节特性、多项分化能力、旁分泌功能及医美保健等功能，使其成为临床细胞疗法的热点。而包皮(fsk)是一种生物废物，主要是从婴幼儿和儿童包皮环切术等手术后的生物废弃物，既往、现在都作为生物垃圾抛弃，由医院集中做无害化处理。
3.相关研究表明，包皮来源的间充质干细胞具有间充质干细胞的表型和多向分化潜能，符合国际细胞治疗学会(isct)标准，并且包皮来源的间充质干细胞具有更强的免疫调控能力，更适合于临床免疫性疾病和脓毒症等的治疗。包皮来源间充质干细胞除可以个体保存，以备自己及家人需求外，还可能是工业化间充质干细胞的来源。然而单份包皮来源的间充质干细胞有两个重大缺陷：其一，单份包皮间充质干细胞细胞获得量较小，一般包皮环切术取得的单个包皮组织仅0.5-1.0克，间充质干细胞含量有限，不适合用于大规模工业化培养；其二，不同个体单份包皮间充质干细胞之间有较大的个体异质性，效能不稳定。
4.基于此，需寻求一种能够解决不同个体单份包皮间充质干细胞的异质性，获得功能稳定、均一，且适合临床使用的间充质干细胞培养方法。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种混合培养包皮获得间充质干细胞的方法及其应用，能够解决不同个体单份包皮间充质干细胞的异质性，获得功能稳定、均一，且适合临床使用。
6.本发明还提出一种采用上述混合培养方法获得间充质干细胞或细胞库。
7.本发明还提出一种采用上述混合培养方法获得间充质干细胞在制备治疗和/或改善免疫性疾病产品中的应用。
8.本发明还提出一种采用上述混合培养方法获得间充质干细胞在制备治疗和/或改善脓毒症产品中的应用。
9.本发明还提出一种采用上述混合培养方法获得间充质干细胞在制备治疗和/或改善组织缺损性疾病产品中的应用。
10.本发明还提出一种采用上述混合培养方法获得间充质干细胞在制备治疗和/或改善组织细胞功能性疾病产品中的应用。
11.本发明的第一方面，提供一种混合培养包皮获得间充质干细胞的方法，包括将n份不同来源的包皮与培养基混合，培养，得到p0代间充质干细胞；
12.所述n大于等于2。
13.根据本发明实施例的方法，至少具有如下有益效果：本发明的培养方法可混合培养多份不同来源的包皮，能够克服单个包皮组织间充质干细胞含量有限的不足，满足工业化大量培养；此外，根据混合培养获得的包皮组织间充质干细胞表型和表面抗原分析结果可知，本发明的培养方法能够克服个体间充质干细胞功能异质性，且获得的细胞功能稳定均一。
14.本发明混合培养的包皮来源间充质干细胞具有独特的生物学特性和临床应用价值，具体表现在一下几个方面：
15.(1)解决了工业化量产的问题，采用本发明多个包皮组织混合培养方法，克服了单个包皮组织量少，培养获得的间充质干细胞数量无法满足多个个体的使用的问题；
16.(2)解决了不同包皮来源个体间充质干细胞异质性的问题，采用本发明的多个包皮组织混合培养方法获得的间充质干细胞，能克服不同个体间充质干细胞之间的异质性，获得功能稳定、均一的间充质干细胞；
17.(3)提高了包皮间充质干细胞培养效率，采用本发明多个包皮组织的混合培养方法，能提高间充质干细胞的产出率，单位重量的包皮组织获得的间充质干细胞能提高一倍以上；
18.(4)采用本发明混合培养方法获得的包皮间充质干细胞符合国际细胞治疗学会(isct)标准，高表达mscs表型，表达cd73、cd90和cd105，缺乏造血谱系标记cd45、cd34、cd11c、cd14、cd19、cd79a和hla-dr，且表达干性标记pou5f1、nanog、podxl、sox2。
19.根据本发明的一些实施例，所述包皮为包皮真皮组织；
20.优选地，所述包皮真皮组织的获取方法为：
21.步骤s1、将包皮环切术后的包皮依次用碘伏浸泡、酒精消毒和磷酸盐缓冲盐水清洗后备用；
22.步骤s2、对所述不同来源包皮进行纵向切片以扩散组织，分离表皮和真皮，然后将所述真皮切成小块形成组织匀浆即得。
23.根据本发明的一些实施例，所述步骤s1中的碘伏浸泡时间为1min～3min；
24.优选地，所述酒精消毒的时间为30s～90s。
25.根据本发明的一些实施例，所述酒精的浓度为70％～85％；
26.优选的，所述酒精的浓度为75％。
27.根据本发明的一些实施例，所述培养基为含有fbs的dmem/f12培养基或间充质干细胞无血清培养基。
28.根据本发明的一些实施例，所述dmem/f12培养基中的fbs的浓度为8～12％；
29.优选地，所述dmem/f12培养基中的fbs的浓度为10％。
30.根据本发明的一些实施例，所述间充质干细胞无血清培养基中的青霉素/链霉素的浓度为45u/ml～55u/ml；
31.优选地，所述间充质干细胞无血清培养基中的青霉素/链霉素的浓度为50u/ml。
32.根据本发明的一些实施例，所述培养的条件为37
±
1℃、体积分数为4％～6％co2的恒温恒湿培养箱；
33.优选地，所述培养的条件为37℃、体积分数为5％co2的恒温恒湿培养箱。
34.根据本发明的一些实施例，所述方法还包括扩大培养；
35.优选地，所述扩大培养可以采用p0代间充质干细胞或pn代间充质干细胞进行培养，其中所述n≥1，且n为整数。
36.根据本发明的一些实施例，当采用p0代间充质干细胞进行扩大培养时，所述扩大培养具体包括：
37.将所述p0代间充质干细胞悬液与微载体培养液混合培养，沉淀微载体和间充质干细胞，加入胰蛋白酶消化，消化完成后收集上清液中的间充质干细胞即可。
38.根据本发明的一些实施例，所述微载体培养液的制备方法包括：
39.步骤s01、取cytodex1微载体用杜氏磷酸缓冲盐溶液泡发2.5h～3.5h，沉淀cytodex1微载体，再用杜氏磷酸缓冲盐溶液洗涤；
40.步骤s02、将洗涤后的所述cytodex1微载体浸泡于杜氏磷酸缓冲盐溶液，灭菌后沉淀，弃上清，加入间充质干细胞无血清培养基后即得。
41.根据本发明的一些实施例，所述p0代间充质干细胞悬液的细胞接种浓度为(5～7)
×
103cells/cm2；
42.优选地，所述微载体培养液中所述微载体的浓度为2g/l～4g/l；
43.所述p0代间充质干细胞悬液与微载体培养液的体积比为1:10～30。
44.根据本发明的一些实施例，所述混合培养的时间为10天～14天。
45.根据本发明的一些实施例，所述混合培养的条件为37
±
1℃、体积分数为4％～6％co2的恒温恒湿培养箱。
46.优选的，所述混合培养的条件为37℃、体积分数为5％co2的恒温恒湿培养箱。
47.根据本发明的一些实施例，所述混合培养过程是在转瓶中进行；
48.优选的，所述转瓶的转速为30rpm～60rpm。
49.优选的，所述转瓶的转速设置转速和模式为：
50.day0：50rpm处理5min，0rpm处理23h 55min；
51.day1-day4：35rpm恒速模式。
52.根据本发明的一些实施例，所述混合培养包皮获得间充质干细胞的方法，具体包括以下步骤：
53.步骤s11、将包皮环切术后的不同来源包皮分别依次用碘伏浸泡、酒精消毒和磷酸盐缓冲盐水清洗后，放入培养皿中备用；
54.步骤s12、分别对所述不同来源包皮进行纵向切片以扩散组织，分离表皮和真皮，然后将所述真皮切成小块形成组织匀浆，最后再将不同来源的所述组织匀浆混合；
55.步骤s13、将混合后的所述组织匀浆均匀接种于培养瓶中，平置培养瓶使组织块尽量均匀分布于整个底面，加入培养基进行原代培养获得p0代间充质干细胞悬液；
56.步骤s14、将所述p0代间充质干细胞悬液与微载体培养液混合培养10～14天后，沉淀微载体和间充质干细胞，加入胰蛋白酶消化，消化完成后收集上清液中的间充质干细胞即可。
57.根据本发明的一些实施例，步骤s13中所述原代培养的培养基为含有fbs的dmem/f12培养基或间充质干细胞无血清培养基；
58.优选的，所述dmem/f12培养基中的fbs的浓度为8～12％；
59.优选地，所述间充质干细胞无血清培养基中的青霉素/链霉素的浓度为45u/ml～55u/ml；
60.优选地，所述培养的条件为37
±
1℃、体积分数为4％～6％co2的恒温恒湿培养箱。
61.根据本发明的一些实施例，步骤s14中，所述混合培养的温度为37
±
1℃，所述培养过程中二氧化碳的体积分数为4％～6％。
62.本发明的第二方面，提供一种采用上述方法培养得到的间充质干细胞或细胞库。
63.由于获得的间充质干细胞采用了上述实施例的方法的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
64.本发明的第三方面，提供一种上述间充质干细胞在在(a)～(d)任一项中的应用：
65.(a)制备治疗和/或改善免疫性疾病产品；
66.(b)制备治疗和/或改善脓毒症产品；
67.(c)制备治疗和/或改善组织缺损性疾病产品；
68.(d)制备治疗和/或改善组织细胞功能性疾病产品。
69.本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
70.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
71.图1为本发明实施例在微载体上表达绿色荧光的间充质干细胞图。
72.图2为本发明单份包皮组原代培养的间充质干细胞形态图。
73.图3为本发明双份包皮混合组原代培养的间充质干细胞形态图。
74.图4为本发明三份包皮混合组原代培养的间充质干细胞形态图。
75.图5为本发明单份包皮组p3代培养的间充质干细胞形态图。
76.图6为本发明双份包皮混合组p3代培养的间充质干细胞形态图。
77.图7为本发明三份包皮混合组p3代培养的间充质干细胞形态图。
78.图8为本发明单份包皮组培养获得的间充质干细胞流式图(cd11b、cd19、hla-dr和cd73)。
79.图9为本发明单份包皮组培养获得的间充质干细胞流式图(cd34、cd45、cd90和cd105)。
80.图10为本发明双份包皮混合组培养获得的间充质干细胞流式图(cd11b、cd19、hla-dr和cd73)。
81.图11为本发明双份包皮混合组培养获得的间充质干细胞流式图(cd34、cd45、cd90和cd105)。
82.图12为本发明三份包皮混合组培养获得的间充质干细胞流式图(cd11b、cd19、hla-dr和cd73)。
83.图13为本发明三份包皮混合组培养获得的间充质干细胞流式图(cd34、cd45、cd90和cd105)。
84.图14为本发明不同包皮培养获得的间充质干细胞增殖曲线图。
具体实施方式
85.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
86.本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
87.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
88.实施例1：双份包皮混合
89.一种双份混合培养包皮获得间充质干细胞的方法，具体包括以下步骤：
90.(1)包皮组织的收集处理：在包皮环切术后，将两份不同来源的包皮样本分别收集到预先准备的含磷酸盐缓冲盐水(pbs，lonza)的无菌样本容器中；
91.(2)包皮组织的消毒：分别将含包皮的无菌样本容器放入干细胞培养间后，用碘伏浸泡1-2分钟、75％的酒精清洗30-60秒灭菌后，再用无菌pbs清洗并转移到无菌培养皿中；
92.(3)包皮组织的匀浆处理：分别对上述消毒后的不同来源包皮进行纵向切片以扩散组织，分离表皮和真皮，然后将真皮切成0.5mm～1mm大小的小块形成组织匀浆，最后再将两份不同来源包皮获得的组织匀浆混合；
93.(4)混合包皮组织匀浆的原代培养：将混合后的组织匀浆均匀接种于培养瓶中，平置培养瓶使包皮真皮组织块尽量均匀分布于整个底面，加入添加50u/ml青霉素/链霉素(lonza)的间充质干细胞无血清培养基(lonza)，置于37℃，体积分数为5％co2的二氧化碳恒温恒湿培养箱中进行原代培养至组织块周围爬出细胞，原代培养5天全量换液一次，以去除非贴壁细胞，当贴壁细胞达到亚融合(80-90％)时，用2.5％胰蛋白酶(gibco，lifetechnologies)消化，获得p0代的包皮来源间充质干细胞，并进行传代，反复传代培养至所需阶段(如p2代、p3代或p4代等)并建立各种细胞库。
94.(5)混合包皮组织匀浆的3d扩大培养
95.本实施例以p0代的包皮来源间充质干细胞为例进行3d扩大培养，具体步骤如下：
96.步骤s1：取适量cytodex1微载体(cytiva公司)用杜氏磷酸缓冲盐溶液(dpbs)泡发3h，分离得到泡发后的cytodex 1微载体，用杜氏磷酸缓冲盐溶液(dpbs)洗涤2次，再用dpbs浸泡后置于121℃下灭菌30min，待cytodex 1微载体冷却沉淀后，弃上清；然后用间充质干细胞无血清培养基洗涤2次，将洗涤后的cytodex 1微载体放入转瓶中，并加入间充质干细胞无血清培养基制备得到3g/l微载体培养液；
97.步骤s2：按照6
×
103cells/cm2接种浓度制备p0代间充质干细胞悬液，并将p0代间充质干细胞细胞悬液与微载体培养液以1:15的比例混合后，将盛有该混合液的转瓶放置在生物反应器上，设置转速和模式：day0：50rpm处理5min，0rpm处理23h 55min；day1-day4：35rpm恒速模式；
98.步骤s3：培养过程根据培养液指示颜色换液，培养至10-14天后，停止生物反应器，将500ml转瓶取出，放进安全柜，静置20min，待微载体和细胞沉淀到转瓶底部，用pbs清洗微载体和细胞，清洗两遍；加入2.5％胰蛋白酶消化30min，待消化完成，收集上清液中的间充质干细胞即得。
99.实施例2：三份包皮混合
100.一种三份混合培养包皮获得间充质干细胞的方法，具体包括以下步骤：
101.(1)包皮组织的收集处理：在包皮环切术后，将三份不同来源的包皮样本分别收集到预先准备的含磷酸盐缓冲盐水(pbs，lonza)的无菌样本容器中；
102.(2)包皮组织的消毒：分别将含包皮的无菌样本容器放入干细胞培养间后，用碘伏浸泡1-2分钟、75％的酒精清洗30-60秒灭菌后，再用无菌pbs清洗并转移到无菌培养皿中；
103.(3)包皮组织的匀浆处理：分别对上述消毒后的不同来源包皮进行纵向切片以扩散组织，分离表皮和真皮，然后将真皮切成0.5mm～1mm大小的小块形成组织匀浆，最后再将三份不同来源包皮获得的组织匀浆混合；
104.(4)混合包皮组织匀浆的原代培养：将混合后的组织匀浆均匀接种于培养瓶中，平置培养瓶使包皮真皮组织块尽量均匀分布于整个底面，加入添加50u/ml青霉素/链霉素(lonza)的间充质干细胞无血清培养基(lonza)，置于37℃，体积分数为5％co2的二氧化碳恒温恒湿培养箱中进行原代培养至组织块周围爬出细胞，原代培养5天全量换液一次，以去除非贴壁细胞，当贴壁细胞达到亚融合(80-90％)时，用2.5％胰蛋白酶(gibco，lifetechnologies)消化，获得p0代的包皮来源间充质干细胞，并进行传代，反复传代培养至所需阶段(如p2代、p3代或p4代等)并建立各种细胞库。
105.(5)混合包皮组织匀浆的3d扩大培养
106.本实施例以p0代的包皮来源间充质干细胞为例进行3d扩大培养，具体步骤如下：
107.步骤s1：取适量cytodex1微载体用dpbs泡发3h，分离得到泡发后的cytodex 1微载体，用杜氏磷酸缓冲盐溶液(dpbs)洗涤2次，再用dpbs浸泡后置于121℃下灭菌30min，待cytodex 1微载体冷却沉淀后，弃上清；然后用间充质干细胞无血清培养基洗涤2次，将洗涤后的cytodex 1微载体放入转瓶中，并加入间充质干细胞无血清培养基制备得到3g/l微载体培养液；
108.步骤s2：按照6
×
103cells/cm2接种浓度制备p0代间充质干细胞悬液，并将p0代间充质干细胞细胞悬液与微载体培养液以1:15的比例混合后，将盛有该混合液的转瓶放置在生物反应器上，设置转速和模式：day0：50rpm处理5min，0rpm处理23h 55min；day1-day4：35rpm恒速模式；
109.步骤s3：培养过程根据培养液指示颜色换液，培养至10-14天后，停止生物反应器，将500ml转瓶取出，放进安全柜，静置20min，待微载体和细胞沉淀到转瓶底部，用荧光显微镜可观察到贴附在微载体上表达绿色荧光的间充质干细胞，具体如图1所示，去除上清液；用pbs清洗微载体和细胞，清洗两遍；加入2.5％胰蛋白酶消化30min，待消化完成，收集上清液中的间充质干细胞即得。
110.对比例：单份包皮培养
111.一种利用单份包皮获得间充质干细胞的方法，具体包括以下步骤：
112.(1)包皮组织的收集处理：在包皮环切术后，将单份包皮样本收集到预先准备的含
磷酸盐缓冲盐水(pbs，lonza)的无菌样本容器中；
113.(2)包皮组织的消毒：将含包皮的无菌样本容器放入干细胞培养间后，用碘伏浸泡1-2分钟、75％的酒精清洗30-60秒灭菌后，再用无菌pbs清洗并转移到无菌培养皿中；
114.(3)包皮组织的匀浆处理：对上述消毒后的包皮进行纵向切片以扩散组织，分离表皮和真皮，然后将真皮切成0.5mm～1mm大小的小块形成组织匀浆；
115.(4)混合包皮组织匀浆的原代培养：将组织匀浆均匀接种于培养瓶中，平置培养瓶使包皮真皮组织块尽量均匀分布于整个底面，加入添加50u/ml青霉素/链霉素(lonza)的间充质干细胞无血清培养基(lonza)，置于37℃，体积分数为5％co2的二氧化碳恒温恒湿培养箱中进行原代培养至组织块周围爬出细胞，原代培养5天全量换液一次，以去除非贴壁细胞，当贴壁细胞达到亚融合(80-90％)时，用2.5％胰蛋白酶(gibco，lifetechnologies)消化，获得p0代的包皮来源间充质干细胞，并进行传代，反复传代培养至所需阶段(如p2代、p3代或p4代等)并建立各种细胞库。
116.(5)包皮组织匀浆的3d扩大培养
117.本实施例以p0代的包皮来源间充质干细胞为例进行3d扩大培养，具体步骤如下：
118.步骤s1：取适量cytodex1微载体用dpbs泡发3h，分离得到泡发后的cytodex 1微载体，用杜氏磷酸缓冲盐溶液(dpbs)洗涤2次，再用dpbs浸泡后置于121℃下灭菌30min，待cytodex 1微载体冷却沉淀后，弃上清；然后用间充质干细胞无血清培养基洗涤2次，将洗涤后的cytodex 1微载体放入转瓶中，并加入间充质干细胞无血清培养基制备得到3g/l微载体培养液；
119.步骤s2：按照6
×
103cells/cm2接种浓度制备p0代间充质干细胞悬液，并将p0代间充质干细胞细胞悬液与微载体培养液以1:15的比例混合后，将盛有该混合液的转瓶放置在生物反应器上，设置转速和模式：day0：50rpm处理5min，0rpm处理23h 55min；day1-day4：35rpm恒速模式；
120.步骤s3：培养过程根据培养液指示颜色换液，培养至10-14天后，停止生物反应器，将500ml转瓶取出，放进安全柜，静置20min，待微载体和细胞沉淀到转瓶底部，去除上清液；用pbs清洗微载体和细胞，清洗两遍；加入2.5％胰蛋白酶消化30min，待消化完成，收集上清液中的间充质干细胞即得。
121.检测例
122.本检测例取9例包皮环切术后的不同来源包皮组织，并分别将其真皮与表皮分离，其中称取第1例包皮的真皮组织0.03g剪碎成小块，制成匀浆，标记为单份包皮组c；分别称取第1例和第2例两个来自不同个体来源的真皮组织0.015g，并进行混合，总重量约为0.03g，将其一同剪碎成小块，制成组织匀浆，标记为双份包皮混合组d；分别称取第1例、第2例和第3例三个来自不同个体来源的真皮组织0.01g，并进行混合，混合后总重量为0.01g，将其一同剪碎成小块，制成组织匀浆，标记为三份包皮混合组e；以此类推，每组均含3个生物学重复。具体如表1所示。
123.表1：包皮组织分组
[0124][0125][0126]
其中，单份包皮组采用对比例1的方法进行培养；双份包皮混合组采用实施例1的方法进行培养；三份包皮混合组采用实施例2的方法进行培养，培养期间观察细胞贴壁及生长情况。
[0127]
(一)间充质干细胞形态学分析
[0128]
对上述单份包皮组、双份包皮混合组和三份包皮混合组培养获得的原代培养包皮来源间充质干细胞(p0代)进行形态学分析，结果发现其组内都表现出了相同的形态特征，其中典型的单份包皮组、双份包皮混合组和三份包皮混合组细胞特征如图2～4所示。
[0129]
从图中可以看出在相差显微镜下，单份包皮组、双份包皮混合组和三份包皮混合组培养获得的包皮来源间充质干细胞均呈成纤维细胞样，细胞呈细长梭形形态，并且双份包皮混合组和三份包皮混合组包皮培养获得的间充质干细胞生长状况优于单份包皮组。
[0130]
进一步的，继原代培养后，传代培养至p3代时，单份包皮组、双份包皮混合组和三份包皮混合组培养获得的包皮来源间充质干细胞如图5～7所示。从图中可以看出，单份包皮组、双份包皮混合组和三份包皮混合组培养获得的包皮来源间充质干细胞从形态学上是一致的。
[0131]
(二)间充质干细胞表型鉴定
[0132]
通过流式细胞术对上述单份包皮组c、双份包皮混合组d和三份包皮混合组e培养获得的p3代包皮来源间充质干细胞进行细胞表型鉴定，具体的检测步骤如下：
[0133]
步骤1：取1支流式管，加入100μl包皮来源间充质干细胞悬液(细胞数约1.5
×
105)；
[0134]
步骤2：加1ml孵育缓冲液洗涤，300g离心5min，去除上清液，重复2次；
[0135]
步骤3：加入200微升孵育缓冲液，重悬，均分成1、2管；
[0136]
步骤4：室温封闭5min。
[0137]
步骤5：管1加入同型对照抗体；管2加入cd73/cd90/cd105/cd34/cd45/cd19/cd11b/hla-dr的抗体，避光孵育1h。
[0138]
步骤6：同步骤2，用孵育缓冲液清洗，离心回收细胞，再加入1ml孵育缓冲液重悬，混匀，500g离心5min，第二次去除上清液时，底部留约200μl液体，混匀；轻轻混匀，1h内上机。测试结果如表2所示：
[0139]
表2：混合培养的p3代包皮来源间充质干细胞表面标记抗原表达情况
[0140][0141]
单份包皮组c培养获得的间充质干细胞流式图如图8和图9所示，其中“红色”区域表示未染色样本，“蓝色”区域表示特异性抗体染色；
[0142]
双份包皮混合培养组d获得的间充质干细胞流式图如图10和图11所示，其中“红色”区域表示未染色样本，“蓝色”区域表示特异性抗体染色；
[0143]
三份包皮混合培养组e获得的间充质干细胞流式图如图12和图13所示，其中“红色”区域表示未染色样本，“蓝色”区域表示特异性抗体染色。
[0144]
由上述可知，通过流式细胞术使用一组表面标记建立细胞表型，显示无论单份包皮组包皮培养还是三份包皮混合组包皮混合培养获得的间充质干细胞流式表型是一致的，cd73、cd90和cd105表达大于95％，而cd34、cd45、cd11b、cd19和hla-dr表达小于2％。三份包皮混合组包皮混合培养获得的间充质干细胞mscs标志物分化簇cd73、cd90和cd105的阳性细胞及其对cd45、cd34、cd11b、cd19和人类白细胞抗原hla-dr的阴性细胞，说明不同包皮来源混合培养获得的间充质干细胞的确具有间充质干细胞(mscs)表型，符合国际细胞治疗学会(isct)标准。
[0145]
(三)间充质干细胞获得量测定
[0146]
采用countess
tm
细胞计数仪分别对上述单份包皮组c、双份包皮混合组d和三份包皮混合组e培养获得的p0代包皮来源间充质干细胞进行测定，具体检测方法为：
[0147]
将贴壁的p0代包皮来源间充质干细胞用0.25％胰蛋白酶消化后，加入培养基终止消化，制成单细胞悬液，轻柔吹打混匀。取10μl细胞悬液加入至10μl台盼蓝染料中，再次吹打并轻轻混匀，从中取10μl混合溶液加至countess
tm
细胞计数板一侧的细胞计数池口中。将细胞计数板插入countess
tm
自动细胞计数仪上检测，即可读出存活细胞浓度。每个样本测量3次。
[0148]
检测结果表明：单份包皮组c培养的间充质干细胞浓度为(6
±
0.87)
×
105cells/ml，两份包皮混合组d培养的间充质干细胞浓度为(7.435
±
1.37)
×
105cells/ml，三份包皮
混合组e培养的间充质干细胞浓度为(9.17
±
0.72)
×
105cells/ml，按照每次传代比例计算，当将0.03g包皮组织单份培养到p5代时，可获得约1.17
×
109细胞，双份混合培养可获得约1.45
×
109细胞，三份混合培养可获得约1.78
×
109细胞。由此可见，同样重量的包皮组织，双份包皮混合培养比单份培养增加23.9％的间充质干细胞获得量；三份包皮混合培养比单份包皮组织培养增加52.1％的间充质干细胞获得量。
[0149]
(四)间充质干细胞增殖速率测定
[0150]
分别对上述单份包皮组c、双份包皮混合组d和三份包皮混合组e培养获得的p4代包皮来源间充质干细胞的增殖情况进行测定，具体检测步骤为：
[0151]
分别将单份包皮组c、双份包皮混合组d和三份包皮混合组e培养获得的包皮来源间充质干细胞悬液接种至96孔板中，每孔接种100μl(约2000个细胞)，对照组加入不含细胞的常规培养基，每组设置3个复孔，置于37℃、体积分数为5％的co2恒温培养箱中培养。分别于第1、2、3、4、5、6、7天取出适量进行检测，检测前向每孔中加入10μlcck8溶液，37℃、体积分数为5％的co2条件下孵育2小时，然后用自动酶标仪测定450nm处的od值。以od值(3孔的平均值)为纵轴，培养时间为横轴，绘制增殖曲线。实验重复三次。
[0152]
增殖曲线结果如图14所示，增殖曲线表明：随着培养时间的增加，单份包皮组、双份包皮混合组和三份包皮混合组的od值变大，间接反映了细胞数量增多，其中三份包皮混合组细胞的增殖能力强于剩余两组。选取培养第4、6天的od值行单因素方差分析结果显示3组差异有显著性意义(p《0.05)。
[0153]
综上所述，本发明提供了一种混合培养包皮获得间充质干细胞的方法，能够解决不同个体单份包皮间充质干细胞的异质性，获得功能稳定、均一，且适合临床使用的间充质干细胞培养方法。
[0154]
其次，本发明的多份包皮组织混合培养，一方面能获得工业化生产量的要求，在真皮组织培养时，可以使用大型2d培养瓶，获得p0代细胞后，也能转入大型3d培养罐，获得能支持临床多次使用剂量的间充质干细胞；另一方面，通过多份包皮组织混合培养获得的间充质干细胞，可以克服单份包皮组织培养带来的异质性。其中，多份包皮组织混合培养获得的间充质干细胞中不同间充质干细胞功能亚群的比例，是不同个体来源不同间充质干细胞功能亚群比例的均值。相比较单份包皮组织培养获得的间充质干细胞，多份包皮组织混合培养获得的间充质干细胞可以获得稳定比例的间充质干细胞功能亚群，克服了单份培养带来的个体异质性，具有广泛的应用价值。
[0155]
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。