牛呼吸道合胞体病毒实时荧光定量PCR检测的引物探针组及检测方法

本发明属于病毒检测，具体涉及一种牛呼吸道合胞体病毒实时荧光定量pcr检测的引物探针组及检测方法。

背景技术：

1、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus，brsv)是一种单股负链rna病毒，属于副黏病毒科(paramyxoviridae)，是牛呼吸道合胞体病(bovinerespiratory syncytial disease，brsd)的病原体，也是牛呼吸道疾病综合征(bovinerespiratory disease complex，brdc)主要的病毒性病原之一。brsv主要通过呼吸道气溶胶和体表接触进行传播，具有较强的传染性。

2、brsv可感染多种反刍动物，其中以牛最易感。动物感染后可能不表现出任何临床症状，作为传染源长期排毒；急性期的奶牛以严重间质性肺炎为主要特征，还伴有临床症状，如体温升高、呼吸困难且急促、产奶量显著下降或废绝，妊娠母牛严重时可致流产。每年因呼吸道疾病侵袭的养殖场生产效率大幅降低，造成动物死亡，治疗及预防等养殖成本增加，对我国畜牧业的发展造成较大的影响。建立针对brsd的快速、准确的检测方法是有效控制brsd发生与流行、减少因该病造成的损失的重要措施。

3、目前应用于brsd检测的方法主要有血清学诊断、病毒分离鉴定、分子生物学诊断(逆转录-聚合酶链式反应、环介导等温扩增技术等)。然而现有的这些检测技术步骤比较繁琐且只能定性分析病毒是否存在。

4、比如，环介导等温扩增技术(lamp)是一种新型的分子生物学的检测手段，该反应在bst dna聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸盐(dntps)、硫酸镁、甜菜碱和酶缓冲溶液及多条引物(内引物长度约为40～42bp，外引物长度约为17～20bp，环向前引物和环向后引物，长度约为20bp)的参与下，可识别靶dna的多个不同序列。该反应无需经历dna变性、退火、延伸等过程，在60℃～65℃的条件下即可进行。但是环介导等温扩增技术具有灵敏性低、引物设计复杂、极易污染、只能定性检测不能对样品进行定量检测等缺点。

5、逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，rt-pcr)技术是对病毒目的基因片段特异性扩增的一种检测方法。在该检测方法中，首先需要将病毒的rna逆转录为cdna后再进行pcr检测，反应体系经过三步温度循环，经历变性、引物杂交和延伸三个过程，使dna分子数量以指数形式增加，扩增完成后通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行目的条带检测。逆转录聚合酶链式反应技术具有快速、特异性强且灵敏度高的优点，但只能对样本进行定性检测，无法对样本定量检测。

6、实时荧光定量pcr(real-time quantitative polymerase chain reaction，qpcr)是以pcr技术为基础，结合dna荧光标记技术的一种病原体检测技术。通过qpcr的扩增过程，反应混合物中cdna分子数量增加，进而荧光强度增加。qpcr检测技术克服了pcr检测技术中的定量检测和假阳性的弊端，具有灵敏度高、假阳性率低等优点，是检测病原体的重要技术手段。

7、qpcr检测技术主要分为荧光染料法与taqman荧光探针法。前一种方法中，使用的sybr green i是一种非特异性dna标记染料，可与dna双链上的小沟发生特异性结合，在激发光源的照射下发出荧光信号，荧光信号强度即可表示双链dna分子数量。由于sybr greeni染料可以与所有的双链dna相结合，引物二聚体、单链二级结构及错误的扩增产物同样也会引起dna分子发生荧光，影响检测的准确性，因此需要借助溶解曲线来分析检测结果。但实时荧光定量pcr检测法中的sybr green i染料法具有特异性差、易出现假阳性的缺点。

8、taqman探针是一种单链寡核苷酸，核苷酸序列的5’端使用发光基团修饰，3’端使用淬灭基团修饰。在探针未与dna序列结合时，荧光基团的荧光信号被淬灭基团吸收，而当核酸序列经过变性、延伸后，探针与cdna序列结合，荧光基团和淬灭基团分离，荧光基团发出荧光信号。随着扩增反应的不断进行，dna分子数量增加，荧光基团发出荧光信号强度逐渐增加，经荧光检测器检测后，能够在软件中记录在循环反应过程中的循环阈值与荧光强度的对应关系。此外，taqman探针法与sybr green i染料法相比更加灵敏，还可有效避免引物二聚体等带来的假阳性结果。

9、实时荧光定量pcr技术可以弥补以上检测方法的不足，具有提高灵敏度且特异性强、快速定量检测等多种优点。因此实时荧光定量pcr作为一个灵敏度高、特异性强的检测方法，操作便捷且同时可以对样本进行实时定量检测。而一步法实时荧光定量pcr技术相比其他检测方法，具备操作周期短、灵敏度高且可以对病毒进行定量检测等优点。

10、现有技术中，公开号为cn113684315a的中国专利文献记载了一种用于检测牛呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用，该用于检测牛呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用，基于多重荧光pcr能够快速准确地同时鉴别牛四种主要的呼吸道病毒(bhv-1、brsv、bpiv-3和bvdv)。由于需要针对多种病毒同时检测，限制了检测灵敏度，且检测完毕后，还需要进一步确认属于哪一种或哪几种病毒，对brsv的检测效率较低。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种牛呼吸道合胞体病毒实时荧光定量pcr检测的引物探针组及检测方法，解决现有技术中对牛呼吸道合胞体病毒的检测灵敏度及效率低下的技术问题。

2、为解决上述技术问题，本发明的第一方面是提供一种牛呼吸道合胞体病毒实时荧光定量pcr检测的引物探针组，包括：

3、上游引物brsv-m-f，其核苷酸序列如seq id no.1所示；

4、下游引物brsv-m-r，其核苷酸序列如seq id no.2所示；

5、探针brsv-m-p，其核苷酸序列如seq id no.3所示。

6、优选的，所述探针的5’端带有荧光报告基团，3’端带有荧光淬灭基团。

7、优选的，所述荧光报告基团为fam，所述荧光淬灭基团为bhq1。

8、本发明的第二方面是提供由包含上述的引物探针组的用于实时荧光定量pcr检测牛呼吸道合胞体病毒的检测方法，包括以下步骤：

9、(1)提取待测病毒样品rna；

10、(2)用上游引物brsv-m-f、下游引物brsv-m-r、探针brsv-m-p及qrt-pcr扩增试剂盒对rna中目的条带进行pcr扩增反应；

11、(3)对pcr扩增反应产物进行分析。

12、优选的，在所述步骤(2)中，进行pcr扩增反应的反应体系成分如下：2×one stepu+mix为10μl，one step u+enzyme mix为1μl，10μmol/l的上游引物brsv-m-f为0.4μl，10μmol/l的下游引物brsv-m-r为0.4μl，10μmol/l的探针brsv-m-p为0.4μl，nuclease-freewater为5.8μl，质粒模板为2μl，反应体系为20μl。

13、优选的，所述质粒模板的检测下限为10copies/μl。

14、优选的，所述步骤(2)中反应条件为：95℃30s预变性；95℃10s、54℃30s，共40个循环。

15、优选的，在所述步骤(3)中，对pcr扩增反应产物进行分析包括定性分析和采用荧光定量pcr标准曲线进行定量分析，其中，所述荧光定量pcr标准曲线的构建方式如下：

16、以提取的牛呼吸道合胞体核酸rna为模板，使用逆转录试剂盒反转录为cdna后，用上游引物brsv-m-f、下游引物brsv-m-r及pcr扩增试剂盒对目的条带进行扩增，扩增片段预期大小为141bp；pcr产物经纯化后与pmd18-t进行连接，构建质粒标准品pmd18-t-brsv-m；

17、将pmd18-t-brsv-m质粒标准品进行10倍梯度稀释，选取109～102copies/μl等8个稀释度的质粒作为模板，每个稀释度设置三个重复，并设置ddh2o为体系阴性对照，在合适的反应条件下对模板进行扩增，根据扩增反应结果中的ct值和相对应的模板拷贝数进行荧光定量pcr标准曲线的绘制。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

19、1、基于该牛呼吸道合胞体病毒实时荧光定量pcr检测的引物探针组构建的pcr反应体系在用于牛呼吸道合胞体病毒检测时，具有灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好的优势，最低可检测10copies/μl，可用于brsd流行病学检测，且可对brsv的感染程度进行精确定量，为开展brsv分子流行病学和致病机理奠定基础。

20、2、基于该牛呼吸道合胞体病毒实时荧光定量pcr检测的引物探针组构建的pcr反应体系针对brsv这一种病毒进行一步法检测，有利于提高对牛呼吸道合胞体病毒的检测灵敏度及效率。