一种分支型聚乙二醇连接子及其用途的制作方法

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种分支型聚乙二醇连接子及其应用。


背景技术：

2.抗体药物偶联物(antibodydrugconjugate，adc)是一类新型的靶向治疗药物，由靶向特异性抗原的单克隆抗体和小分子细胞毒药物通过连接子偶联而成，其联合了抗体及细胞毒药物两者的优势，与传统的小分子抗肿瘤药物相比，具有靶向性强、细胞毒性高、降解半衰期长、毒副作用低等特点。随着和等14个药物由fda批准上市，近年来adc药物发展迅速，目前大约有110个adc药物处于临床试验中。
3.adc一般由抗体(antibody)、小分子细胞毒素(cytotoxin)和连接子(linker)三个部分组成。其中连接子的设计对adc药物具有重要的意义，其本身必须使得药物在血液循环系统中保持稳定，以及到达靶组织之后可以快速有效地释放活性毒素。开发adc连接子，存在着多种重要的考量因素，包括抗体的偶联位点、每分子抗体平均偶联细胞毒素的数量(drugtoantibodyratio，dar)、连接子的可裂解性和亲水性等。连接子可分为可裂解连接子和不可裂解连接子两大类，可裂解连接子根据裂解机制的不同分为ph敏感型和酶敏感型。当前，酶敏感型连接子已经成为adc的主流选择。研究比较成熟的酶敏感型连接子为依赖组织蛋白酶b裂解的二肽连接子，如缬氨酸-瓜氨酸(valine-citriline)。目前大多数adc具有共同的结构特征，如通过马来酰亚胺接头连接。adc药物已公开的连接子存在设计比较单一，水溶性不好等问题。
4.关于毒素与抗体的偶联方式，目前已上市adc药物多采用赖氨酸或半胱氨酸随机偶联，由于偶联数目和位点的不确定性，导致生成的抗体药物偶联物的不均一性，进而导致产品各组分间药物动力学性质、效价以及毒性的不均一。为了解决adc均一性问题，近年来定点偶联技术得到了更多的青睐，如基于天然糖基化位点的glycoconnect技术，抗体的fc区域n297糖基化位点在酶催化下，对糖链进行切割并连接上叠氮基团，然后叠氮基团与连接子上的环辛炔通过spaac(strain-promotedcopper-freeclick)反应，形成均一的dar值为2的偶联物。
5.专利文件cn108743968a公开了一种半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，抗体为半胱氨酸定点插入抗体，半胱氨酸插入位点包含kappa/λ轻链恒定区轻链和igg抗体重链恒定区重链两类。
6.但通过基因工程改造的抗体-毒素偶联物引进了药物的不确定性，需要使用还原剂还原抗体，解除抗体上改造的半胱氨酸残基上的屏蔽，并通过阳离子交换层析或超滤换液等方式去除dtt与屏蔽物，然后使用氧化剂氧化抗体，使抗体的链间二硫键重新连接，过程繁琐复杂限制了该发明的使用。
7.专利文件cn103083680b公开了一种具有聚乙二醇-氨基酸寡肽-依诺替康结构通式的药物结合物。在所述结合物中，每一个聚乙二醇端基通过氨基酸寡肽可以与多个依诺替康相连，药物的负载率大大提高。通过亲水性聚合物的改性可对依诺替康提供保护，改善
药物吸收，延长作用时间，增强疗效，降低给药剂量及避免毒副作用。
8.但此抗体药物偶联物的均一性不高，进而导致产品各组分间药物动力学性质、效价以及毒性的不均一、产品批次可重复性较差、治疗指数较低。
9.针对上述现有技术中存在的抗体偶联药物均一性较差、连接子设计较单一、水溶性不好等缺陷，迫切需要开发新的连接子技术。引入聚乙二醇基团，增加连接子亲水性，分支型连接子还可以实现增加载药量的目的，同时使用dbco接头可实现定点偶联，提高抗体药物偶联物的均一性。


技术实现要素：

10.为了解决现有技术中提到的问题，本发明提供了一种分支型聚乙二醇连接子，其具有式(ⅰ)所示结构：
[0011][0012]
其中，所述q选自：其中，所述q选自：中的一种；
[0013]
r5和r6各自独立地具有—x4—q1的结构，q1选自-h、-f、-cl、-br、-i、-so2、-no2、c
1-12
链烷基、c
3-12
环烷基、c
6-12
芳烷基；
[0014]
x4选自由单键、-o-、-s-、c
1-12
链亚烷基、c
3-12
环亚烷基、c
6-12
芳亚烷基、芳亚烷基、及中的一种或多种组成的组；
[0015]
x是连接基团，选自由单键、-o-、-s-、c
1-12
直链/支链亚烷基、c
3-12
环亚烷基、c
6-12
芳亚烷基、亚烷基、及中的一种或多种组成的组，其中r9选自：-h、c
1-10
直链/支链烷基；
[0016]
所述w1、w2独立的选自单键、直链或支链的c
1-6
的烷基；
[0017]
l
1a
，l
1b
，l
1c
独立地选自单键、
[0018]
所述n选自1～24的整数；
[0019]
比如，n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
[0020]
x1、x2是连接基团，独立地选自由单键、-o-、-s-、c
1-12
直链/支链亚烷基、c
3-12
环亚烷基、c
6-12
芳亚烷基、芳亚烷基、及中的一种或多种组成的组；
[0021]
l2、l3是连接基团，为其中a为肽类连接子，b为自降解基团或不存在，
[0022]
当b为自降解基团，b选自：
[0023]
其中，y1、y2各自独立地选自：-h、卤素、-oc
1-10
烷基、c
1-10
直链/支链烷基、c
3-10
环烷基、-oh、
[0024]
y3、y4各自独立地选自：-h、c
1-10
直链/支链烷基、c
3-10
环烷基、环烷基、
[0025]
x3选自由-o-、-s-、c
1-12
直链/支链烷基、c
3-12
环烷基、c
6-12
芳环基、芳环基、芳环基、及或其组合组成的组；
[0026]r20
选自：-h、c
1-12
直链/支链烷基、c
1-12
烷氧基、-no2、-cn、-f、-cl、-br、-i、-so2、c
3-12
环烷基、c
6-12
芳环基、芳环基、
[0027]
a为肽类连接子，包括一个或多个相同或不同的多肽残基，所述的多肽残基包括两个或两个以上相同或不同的氨基酸残基或氨基酸残基衍生物。
[0028]
进一步的，所述q为优选的，所述q为
[0029]
所述r5、r6独立的选自h、c
1-3
的烷基，优选的，r5、r6均为h；
[0030]
所述x选自c
1-12
直链/支链亚烷基、组成的组，其中r9为h、c
1-3
直链/支链烷基；
[0031]
优选的，所述x为所述r7为c
1-12
的亚烷基；更优选的，所述r7为c
1-4
的亚烷基；
[0032]
所述l
1a
，l
1b
，l
1c
独立地选自单键、
[0033]
所述w4选自单键、c
1-6
直链或支链的亚烷基；
[0034]
优选的，所述n选自1～12的整数；
[0035]
所述氨基酸选自：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和胱氨酸中的一种或两种以上的组合；
[0036]
优选的，所述的氨基酸选自：缬氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和精氨酸中的一种或两种以上的组合；
[0037]
更优选的，所述的多肽残基包括缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸和甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸中的一种。
[0038]
进一步的，当b为自降解基团时，所述的a选自
[0039]
其中，a1、a2、a3……ay
为相同或不同，所述a1、a2、a3……ay
结构独立选自：单键、
[0040][0041]
所述y选自1～5的整数；
[0042]
所述j选自1～10的整数；
[0043]
比如，j可以选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数；
[0044]
优选的，所述j为2～4的整数；
[0045]
所述ya选自-h、卤素、-oc
1-10
烷基、c
1-10
直链/支链烷基、c
3-10
环烷基、-oh、-(c
1-6
亚烷基)-oh、-(c
1-6
亚烷基)-sh、-(ch2)
1-6-环烷基、-(c
1-6
亚烷基)-芳环基、-(c
1-6
亚烷基)-杂环烷基、-(c
1-6
亚烷基)-杂环芳香基、-(c
1-6
亚烷基)-cooh、-(c
1-6
亚烷基)-conh2、-(c
1-6
亚烷基)-nh2和中的一种；
[0046]
所述a1、a2、a3……ay
至少有一个结构；
[0047]
优选地，所述的ya选自：-h、-c
1-6
直链/支链烷基、-(c
1-6
亚烷基)-芳环基；
[0048]
更优选的，所述ya选自：-h、甲基、乙基、丙基、异丙基、h、甲基、乙基、丙基、异丙基、
[0049]
进一步的，所述b不存在或选自：
[0050]
优选的，所述b选自：
[0051]
其中，y1、y2各自独立地选自：-h、卤素、-oc
1-10
烷基、c
1-10
直链/支链烷基、c
3-10
环烷基、-oh；
[0052]
y3、y4各自独立地选自：-h、c
1-10
直链/支链烷基、c
3-10
环烷基、环烷基、
[0053]
进一步的，所述q为
[0054]
所述x为
[0055]
所述l
1a
，l
1b
，l
1c
独立地选自单键或
[0056]
所述a选自所述a选自
[0057]
所述b为：或不存在。
[0058]
进一步的，所述l2、l3独立的选自：
[0059]059][0060]
进一步的，所述连接子选自：
[0061]
[0062]
[0063][0064]
本发明另一方面还提供一种分支型聚乙二醇连接子-药物缀合物，具有式(ii)所示结构：
[0065][0066]
其中，所述q选自：其中，所述q选自：中的一种；
[0067]
r5和r6各自独立地具有—x4—q1的结构，q1选自-h、-f、-cl、-br、-i、-so2、-no2、c
1-12
链烷基、c
3-12
环烷基、c
6-12
芳烷基；
[0068]
x4选自由单键、-o-、-s-、c
1-12
链亚烷基、c
3-12
环亚烷基、c
6-12
芳亚烷基、芳亚烷基、及中的一种或多种组成的组；
[0069]
x是连接基团，选自由单键、-o-、-s-、c
1-12
直链/支链亚烷基、c
3-12
环亚烷基、c
6-12
芳亚烷基、亚烷基、及中
的一种或多种组成的组，其中r9选自：-h、c
1-10
直链/支链烷基；
[0070]
所述w1、w2独立的选自单键、直链或支链的c
1-6
的烷基；
[0071]
l
1a
，l
1b
，l
1c
独立地选自单键、
[0072]
所述n选自1～24的整数，可以选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
[0073]
x1、x2是连接基团，独立地选自由单键、-o-、-s-、c
1-12
直链/支链亚烷基、c
3-12
环亚烷基、c
6-12
芳亚烷基、芳亚烷基、及中的一种或多种组成的组，其中r
10
选自：-h、c
1-10
直链/支链烷基；
[0074]
l2’
、l3’
是连接基团，为其中a’为肽类连接子，b’为自降解基团，b’选自：选自：选自：其中，y1、y2各自独立地选自：-h、卤素、-oc
1-10
烷基、c
1-10
直链/支链烷基、c
3-10
环烷基、-oh、
[0075]
y3、y4各自独立地选自：-h、c
1-10
直链/支链烷基、c
3-10
环烷基、
[0076]
x3选自由-o-、-s-、c
1-12
直链/支链烷基、c
3-12
环烷基、c
6-12
芳环基、芳环基、芳环基、及或其组合组成的组；
[0077]r20
选自：-h、c
1-12
直链/支链烷基、c
1-12
烷氧基、-no2、-cn、-f、-cl、-br、-i、-so2、c
3-12
环烷基、c
6-12
芳环基、芳环基、
[0078]
w3为c
1-6
直链/支链亚烷基；
[0079]
所述的肽类连接子包括一个或多个相同或不同的多肽残基，所述的多肽残基包括两个或两个以上相同或不同的氨基酸残基或氨基酸残基衍生物；
[0080]
优选的，所述氨基酸选自：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和胱氨酸中的一种或两种以上的组合，优选地，所述的氨基酸选自：缬氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和精氨酸中的一种或两种以上的组合；更优选的，所述的多肽残基包括缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸和甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸中的一种；
[0081]
所述d为药物分子。
[0082]
进一步的，所述q为进一步的，所述q为优选的，所述q为
[0083]
所述r5、r6独立的选自h、c
1-3
的烷基，优选的，r5、r6均为h；
[0084]
所述x选自c
1-12
直链/支链亚烷基、组成的组，其中r9为h、c
1-3
直链/支链烷基；
[0085]
优选的，所述x为所述r7为c
1-12
的亚烷基；更优选的，所述r7为c
1-4
的亚烷基；
[0086]
所述l
1a
，l
1b
，l
1c
独立地选自单键、
[0087]
所述w4选自单键、c
1-6
直链或支链的烷基；
[0088]
优选的，所述n选自1～12的整数，比如n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
[0089]
比如，所述的a’选自
[0090]
其中，a1、a2、a3……ay
为相同或不同，所述a1、a2、a3……ay
结构独立选自：单键、
[0091][0092]
所述y选自1～10的整数；
[0093]
比如，所述y可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0094]
优选的，所述y为2～4的整数；
[0095]
所述j选自1～10的整数；
[0096]
比如，所述j可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0097]
优选的，所述j为2～4的整数；
[0098]
所述ya选自-h、卤素、-oc
1-10
烷基、c
1-10
直链/支链烷基、c
3-10
环烷基、-oh、-(c
1-6
亚烷基)-oh、-(c
1-6
亚烷基)-sh、-(ch2)
1-6-环烷基、-(c
1-6
亚烷基)-芳环基、-(c
1-6
亚烷基)-杂环烷基、-(c
1-6
亚烷基)-杂环芳香基、-(c
1-6
亚烷基)-cooh、-(c
1-6
亚烷基)-conh2、-(c
1-6
亚烷基)-nh2和中的一种；
[0099]
所述a1、a2、a3……ay
至少有一个结构；
[0100]
优选地，所述的ya选自：-h、-c
1-6
直链/支链烷基、-(c
1-6
亚烷基)-芳环基；
[0101]
更优选的，所述ya选自：-h、甲基、乙基、丙基、异丙基、h、甲基、乙基、丙基、异丙基、
[0102]
所述b’选自：
[0103]
其中，y1、y2各自独立地选自：-h、-oc
1-10
烷基、c
1-10
直链/支链烷基、-oh；y3、y4各自独立地选自：-h、c
1-10
直链/支链烷基；
[0104]
w3选自c
1-6
直链/支链亚烷基；
[0105]
优选的，y1、y2、y3、y4各自独立地选自h、c
1-5
直链/支链烷基。
[0106]
进一步的，所述q为
[0107]
所述x为
[0108]
所述l
1a
，l
1b
，l
1c
独立地选自单键或
[0109]
所述a’选自选自
[0110]
所述b’选自：
[0111]
进一步的，所述l2’
、l3’
独立的选自：
[0112][0113][0114]
进一步的，所述d为化疗剂，选自于：烷基化剂，选自氮芥：氯苯那普，氯普那嗪，环磷酰胺，达喀尔巴嗪，雌二醇氮芥，异环磷酰胺，氮芥，盐酸二甲氧胺，氧化二氮芥，盐酸氨氯地平，麦考酚酸，卫矛醇，呱泊溴烷，新氮芥，苯芥胆甾醇，松龙苯芥，噻替呱，曲磷胺对，尿嘧
啶；cc-1065和阿多来新、卡折来新、比折来新或其合成类似物；多卡霉素及其合成类似物，kw-2189或cbi-tmi、；苯并二氮二聚体或吡咯并苯二氮(pbd)二聚体，托美霉素二聚体，吲哚并苯并二氮杂二聚体，咪唑并苯并噻二氮杂二聚体，或恶唑烷并苯并二氮杂的二聚体；亚硝基脲：包括卡莫司汀，洛莫司汀，氯化梭菌素，福莫司汀，尼莫司汀，拉莫司汀；烷基磺酸盐：包括白苏芬、树苏芬、磺胺异丙磺胺和皮苏芬；三氮烯或达喀尔巴嗪；含铂化合物：包括卡铂，顺铂，奥沙利铂；吖丙啶类，苯并二氢吡喃酮，卡洛酮，美妥替派和乌雷多巴；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺，三亚乙基三胺，三乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基甲基胺；
[0115]
所述d为植物生物碱：选自长春花生物碱，包括长春新碱，长春碱，长春地辛，长春瑞滨，去甲长春碱；紫杉醇类:包括紫杉醇，多西紫杉醇及其类似物；美登素类包括dm1、dm2、dm3、dm4、dm5、dm6、dm7、美登素、安沙霉素及其类似物)；cryptophycin(包括cryptophycin1和cryptophycin8)；埃博霉素，软珊瑚醇，迪莫利德，草苔虫内酯，海兔毒素，澳瑞斯汀，tubulysins，cephalostatin；pancratistatin；erbulins；sarcodictyin；海绵抑制素；
[0116]
所述d为dna拓扑异构酶抑制剂：选自依托泊苷替尼，包括9-氨基喜树碱、喜树碱、克立那托、多拉霉素、依托泊苷、磷酸依托泊苷、伊立替康、依喜替康、dxd、sn38、米托蒽醌、诺消灵、视黄酸(视黄醇)、替尼泊苷、拓扑替康、9-硝基喜树碱或rfs2000、丝裂霉素及其类似物；
[0117]
所述d为选自抗叶酸剂(dhfr抑制剂，包括甲氨蝶呤、曲麦克特、二甲叶酸、蝶罗呤、氨喋呤(4-氨基苯甲酸)或其他叶酸类似物)；imp脱氢酶抑制剂(包括麦考酚酸、噻唑呋林、利巴韦林、eicar)；核糖核苷酸还原酶抑制剂(包括羟基脲、去铁胺)；嘧啶类似物：尿嘧啶类似物(包括安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿嘧啶、卡培他滨(希罗达)、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、ratitrexed(tomudex))和胞嘧啶类似物(包括阿糖胞苷，胞嘧啶阿拉伯糖苷，氟达拉滨)；嘌呤类似物(包括硫唑嘌呤，氟达拉滨，巯嘌呤，硫胺素，硫鸟嘌呤)；叶酸补充剂，弗洛林酸；和烟酰胺磷酸核糖基转移酶(nampt)的抑制剂；
[0118]
所述d为激素疗法剂：选自受体拮抗剂：抗雌激素(包括甲地孕酮，雷洛昔芬，他莫昔芬)，lhrh兴奋剂(包括戈斯他林，醋酸亮丙瑞林)；抗雄激素药(包括比卡鲁胺，氟他胺，卡鲁司酮，丙酸倍他雄酮，表雄甾醇，戈舍瑞林，亮丙瑞林，美替利定，尼鲁米特，睾内酯，曲洛司坦及其他雄激素抑制剂)；维甲类化合物：维生素d3类似物(包括cb1093，eb1089，kh1060，胆钙化醇，麦角钙化甾醇)；光动力疗法剂(包括维替泊芬，酞菁，光敏剂pc4，去甲氧基-竹红菌素a)；细胞因子(干扰素-α，干扰素-γ，肿瘤坏死因子(tnf)，含tnf的人蛋白)；
[0119]
所述d为激酶抑制剂，选自bibw2992(抗-egfr/erb2)，伊马替尼，吉非替尼，呱加他尼，索拉非尼，达沙替尼，舒尼替尼，厄洛替尼，尼洛替尼，拉帕替尼，阿西替尼，帕唑帕尼，凡德他尼，e7080(抗vegfr2)，mubritinib，普纳替尼(ap24534)，bafetinib(inno-406)，bosutinib(ski-606)，卡博替尼，维莫德吉，iniparib，鲁索利替尼，cyt387，阿西替尼，tivozanib，索拉非尼，贝伐单抗，西妥昔单抗，曲妥珠单抗，雷珠单抗，帕尼单抗，伊斯平斯；
[0120]
所述d为聚(adp-核糖)聚合酶(parp)抑制剂，选自奥拉帕里、尼拉帕里、依尼帕里、塔拉佐帕里、维利帕里、维利帕里、cep9722(cephalon)、e7016(eisai)、bgb-290(beigene)、3-氨基苯甲酰酰胺；
[0121]
所述d为抗生素：选自烯二炔类抗生素(选自加利车霉素、加利车霉素γ1、δ1、α1和β1，达因霉素，包括达因霉素a和脱氧米霉素，埃斯培拉霉素，卡塔尔霉素，c-1027，maduropeptin，或新卡嗪奥斯汀和相关色蛋白烯二炔抗生素)，aclacinomysins，放线菌素，安曲霉素，重氮丝氨酸，博来霉素，卡诺霉素，卡拉霉素，洋红霉素，嗜癌素，色霉素，达金霉素，柔红霉素，去柔红霉素，6-重氮-5-氧代-l-去甲亮氨酸，阿霉素，吗啉-阿霉素，氰基吗啉-阿霉素，2-吡咯啉阿霉素和脱氧柔红霉素，表柔比星，阿柔比星，伊达比星，马可霉素，nitomycin，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，peplomycin，potfiromycin，嘌呤霉素，奎拉霉素，罗道霉素，链黑霉素，链脲霉素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；
[0122]
所述d为聚酮化合物(番荔素)，bullatacin和bullatacinone；吉西他滨，环氧酶素和卡菲偌米布，硼替佐米，沙利度胺，来那度胺，pomalidomide，tosedostat，zybrestat，plx4032，sta-9090，stimuvax，allovectin-7，xegeva，provenge，yervoy，异戊二烯化抑制剂和洛伐他汀，多巴胺能神经毒素(选自星形孢菌素)，放线菌素(包含放线菌素d，更生霉素)，鹅膏毒素，博莱霉素(包括博来霉素a2，博莱霉素b2，培洛霉素)，蒽环类抗生素，包括柔红霉素，阿霉素(亚德里亚霉素)，伊达比星，表柔比星，佐柔比星，米托蒽醌，mdr抑制剂(或维拉帕米)，ca2+atp酶抑制剂(或毒胡萝卜素)，组蛋白去乙酰酶抑制剂(伏立诺他，罗米地辛，帕比司他，丙戊酸，mocetinostat(mgcd0103)，belinostat，pci-24781，恩替诺特，sb939，resminostat，givinostat，ar-42，cudc-101，萝卜硫素，曲古抑菌素a)；塞来昔布，格列酮类，表没食子儿茶素没食子酸酯，双硫仑，salinosporamidea；抗肾上腺药物，选自：氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦，醋葡醛内酯，醛磷酰胺，氨基乙酰丙酸，安吖啶，阿拉伯糖苷，bestrabucil，比生群，edatraxate，defofamine，美可辛，地吖醌，依氟鸟氨酸(dfmo)，elfomithine，依利醋铵，依托格鲁，硝酸镓，胞嘧啶，羟基脲，伊班膦酸盐，香菇多糖，氯尼达明，米托胍腙，米托蒽醌，莫呱达醇，二胺硝吖啶，喷司他丁，蛋氨氮芥，吡柔比星，鬼臼酸，2-乙肼，甲基苄肼；呱嗪二酮丙烷；根霉素；西佐；螺环锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；三氯三乙胺；单端孢霉烯(包括t-2毒素，疣孢菌素a，杆孢菌素a和anguidine)，聚氨酯，sirna，反义药物；
[0123]
所述d为自身免疫疾病药物，选自环孢菌素，环孢菌素a，氨基己酸，硫唑嘌呤，溴隐亭，苯丁酸氮芥，氯喹，环磷酰胺，皮质类固醇(包括安西奈德，倍他米松，布地奈德，氢化可的松，氟尼缩松，丙酸氟替卡松，氟可龙达那唑，地塞米松，曲安奈德，二丙酸倍氯米松)，dhea，依那西普，羟基氯喹，英夫利昔单抗，美洛昔康，甲氨蝶呤，麦考酚酸酯，泼尼松，西罗莫司，他克莫司；
[0124]
所述d为抗感染性疾病药物，包括氨基糖苷类：选自阿米卡星，阿司米星，庆大霉素(奈替米星，西索米星，异帕米星)，潮霉素b，卡那霉素(阿米卡星，阿贝卡星，氨基脱氧卡那霉素，地贝卡星，妥布霉素)，新霉素(framycetin，巴龙霉素，核糖霉素)，奈替米星，壮观霉素，链霉素，妥布霉素，甲基姿苏霉素；
[0125]
所述d为抗感染性疾病药物，包括酰胺醇类：选自迭氮氯霉素，氯霉素，氟苯尼考，甲砜霉素；
[0126]
所述d为抗感染性疾病药物，包括安沙霉素：选自格尔德霉素或除莠霉素；
[0127]
所述d为抗感染性疾病药物，包括碳青霉烯类：选自比阿培南，多利培南，厄他培南，亚胺培南/西司他丁，美罗培南，帕尼培南；
[0128]
所述d为抗感染性疾病药物，包括头孢烯：选自碳头孢烯(洛拉卡比)，头孢乙腈，氯氨苄青霉素，头孢拉定，头孢羟氨，头孢洛宁，头孢噻啶，头孢噻吩或头孢金素，头孢氨苄，头孢来星，头孢孟多，头孢匹林，羟胺唑头孢菌素，氟唑头孢菌素，孢西酮，唑啉头孢菌素，头孢拉宗，头孢卡品，头孢达肟，头孢吡，头孢克肟，头孢西丁，头孢罗齐，头孢甲氧环烯胺，头孢替唑，头孢呋辛，头孢克肟，头孢地尼，头孢托仑，头孢吡，头孢他美，头孢甲肟，头孢地嗪，头孢尼西，头孢呱酮，头孢雷特，头孢噻肟，噻乙胺唑头孢菌素，头孢唑兰，头孢氨苄，头孢咪唑，头孢匹胺，头孢匹罗，头孢泊肟，头孢罗齐，头孢喹诺，头孢磺啶，头孢他啶，头孢特仑，头孢布腾，头孢噻林，头孢唑肟，头孢吡普，头孢曲松，头孢呋辛，头孢唑南，头霉素(头孢西丁，头孢替坦，头孢氰唑)，氧(碳)头孢烯(氟氧头孢，拉氧头孢)；
[0129]
所述d为抗感染性疾病药物，包括糖肽：选自博来霉素，万古霉素(奥利万星，特拉万星)，替考拉宁(达巴万星)，雷莫拉宁；
[0130]
所述d为抗感染性疾病药物，包括甘氨酰环素：如替加环素；
[0131]
所述d为抗感染性疾病药物，包括β-内酰胺酶抑制剂：选自青霉烷(舒巴坦，他唑巴坦)，氧青霉烷(克拉维酸)；
[0132]
所述d为抗感染性疾病药物，包括林可酰胺：选自克林霉素或林可霉素；
[0133]
所述d为抗感染性疾病药物，包括脂肽：选自达托霉素，a54145，钙依赖性抗生素(cda)；
[0134]
所述d为抗感染性疾病药物，包括大环内酯类：选自阿奇霉素，克霉素，克拉霉素，地红霉素，红霉素，氟雷霉素，交沙霉素，酮内酯(泰利霉素，塞红霉素)，麦迪霉素，米卡霉素，竹桃霉素，利福霉素(异烟肼、利福平，利福布丁，利福喷汀)，罗匹霉素，罗红霉素，大观霉素，螺旋霉素，他克莫司(fk506)，醋竹桃霉素，泰利霉素；
[0135]
所述d为抗感染性疾病药物，包括单环胺：选自氨曲南或替吉莫南；
[0136]
所述d为抗感染性疾病药物，包括恶唑烷酮类：如利奈唑胺；
[0137]
所述d为抗感染性疾病药物，包括青霉素类：选自阿莫西林，氨苄青霉素(匹氨西林，海洛西林，巴氨西林，氨苄青霉素，阿霉素)，阿替代西林，阿洛西林，苄青霉素，苄星青霉素苄青霉素，苄星青霉素苯氧甲基青霉素，克洛西林，普鲁卡因青霉素(美替西林)，美洛西林，甲氧西林，萘夫西林，苯唑西林，醋甲西林，青霉素，非奈西林，苯氧基甲基青霉素，呱拉西林，氨苄西林，磺苯西林，替莫西林，替卡西林；
[0138]
所述d为抗感染性疾病药物，包括多肽：选自杆菌肽，粘菌素，多粘菌素b；
[0139]
所述d为抗感染性疾病药物，包括喹诺酮类：选自阿拉曲沙星，巴洛沙星，环丙沙星，克林沙，达氟沙星，二氟沙星，依诺沙星，恩诺沙星，加雷沙星，加替沙星，吉米沙星，格帕沙星，卡诺曲伐沙星，左氧氟沙星，洛美沙星，麻保沙星，莫西沙星，那氟沙星，诺氟沙星，奥比沙星，氧氟沙星，培氟沙星，曲伐沙星，格帕沙星，西他沙星，司帕沙星，替马沙星，托沙星，曲伐沙星；
[0140]
所述d为抗感染性疾病药物，包括链阳性菌素：选自普那霉素，奎奴普丁/达福普汀；
[0141]
所述d为抗感染性疾病药物，包括磺胺类：选自氨芐磺胺，偶氮磺胺，磺胺嘧啶，磺胺甲异唑、磺胺酰亚胺、磺胺吡啶、磺胺异恶唑、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑(复方磺胺甲恶唑)；
[0142]
所述d为抗感染性疾病药物，包括类固醇抗菌药物：如夫西地酸；
[0143]
所述d为抗感染性疾病药物，包括四环素类：选自强力霉素，金霉素，氯米西环素，地美环素，雷莫昔林，美西环素，美他环素，米诺环素，土霉素，潘美环素，吡咯烷甲基四环素，四环素，甘氨酰环素(如替加环素)；
[0144]
所述d为抗感染性疾病药物，包括其他类型的抗生素：番荔枝素，胂凡纳明，细菌萜醇抑制剂(杆菌肽)，danal/ar抑制剂(环丝氨酸)，dictyostatin，圆皮海绵内酯，软珊瑚醇，埃博霉素，乙胺丁醇，依托泊苷，法罗培南，夫西地酸，呋喃唑酮，异烟肼，laulimalide，甲硝唑，莫匹罗星，nam合成抑制剂(例如磷霉素)，呋喃妥因，紫杉醇，普兰西霉素，吡嗪酰胺，奎奴普丁/达福普汀，利福平，他唑巴坦替硝唑，乌菊花素；
[0145]
所述d为抗病毒药物，包括侵入/融合抑制剂：选自阿帕韦洛，马拉韦罗，vicriviroc，gp41(恩夫韦肽)，pro140或cd4(艾巴利珠单抗)；
[0146]
所述d为抗病毒药物，包括整合酶抑制剂：选自雷特格韦，elvite-gravir或globoidnana；
[0147]
所述d为所述d为抗病毒药物，包括成熟抑制剂：选自bevirimat或vivecon；
[0148]
所述d为抗病毒药物，包括神经氨酸酶抑制剂：选自奥司他韦，扎那米韦或帕拉米韦；
[0149]
所述d为抗病毒药物，包括核苷和核苷酸：选自阿巴卡韦，阿昔单韦，阿德福韦，阿莫西韦，阿昔单抗，溴夫定，西多福韦，克拉夫定，地塞米松，去羟肌苷(ddi)，elvucitabine，恩曲他滨(ftc)，恩替卡韦，泛昔洛韦，氟拉西林(5-fu)，3
’‑
氟取代的2’，3
’‑
脱氧核苷类似物，包括3
’‑
氟-2’，3
’‑
双脱氧胸苷(flt)和3
’‑
氟-2’，3
’‑
双脱氧鸟苷(flg)，福米韦生，9-鸟嘌呤，碘苷，拉米夫定(3tc)，1-核苷(包括β-1-胸苷和β-1-2'-脱氧胞苷)，喷昔洛韦，racivir，利巴韦林，迪替丁，司他夫定(d4t)，塔利巴韦林(viramidine)，替比夫定，替诺福韦，三氟尿苷伐昔洛韦，缬更昔洛韦，扎西他滨(ddc)或齐多夫定(azt)；
[0150]
所述d为抗病毒药物，包括非核苷类：选自金刚烷胺，阿替吡啶，卡普韦林，二芳基嘧啶(依曲韦林，rilpivirine)，地拉夫定，二十二烷醇，乙米韦林，依法韦仑，膦甲酸(磷酰基甲酸)，咪喹莫特，聚乙二醇干扰素，洛韦胺，洛德腺苷，甲吲噻腙，奈韦拉平，nov-205，长效干扰素α，鬼臼毒素，利福平，金刚乙胺，瑞喹莫德(r-848)或醋胺金刚烷；
[0151]
所述d为抗病毒药物，包括蛋白酶抑制剂：选自安普那韦，阿扎那韦，boceprevir，darunavir，福萨那韦，印地那韦，洛匹那韦，奈非那韦，普来可那立，利托那韦，沙奎那韦，telaprevir(vx-950)或替拉那韦；
[0152]
所述d为抗病毒药物，包括其它类型的抗病毒药物：如抗体酶，阿比朵尔，calanolidea，ceragenin，氰维林-n，二芳基嘧啶，表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)，膦甲酸，格里菲辛，taribavirin(viramidine)，羟基脲，kp-1461，米替福新，普来可那立，混成抑制剂，利巴韦林或seliciclib；
[0153]
所述d为放射性同位素，可以选自(放射性核素)3h、11c、14c、18f、32p、35s、64cu、68ga、86y、99tc、111in、123i、124i、125i、131i、133xe、177lu、211at、或213bi。
[0154]
所述d为发色团分子，能够吸收紫外线、荧光、红外光、近红外光、可见光；黄色素、红细胞、虹彩色素、白细胞、黑色素和蓝绿色素的一类或一个亚类、荧光分子吸收光后再发光的荧光化学物质。视觉光转导分子、荧光团分子、发光分子、萤光素化合物。非蛋白质有机荧光团，选自：氧杂蒽衍生物(包括荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、伊红和德克萨斯红)；花青衍
生物(包括花青、吲哚羰花青、氧杂花青、硫代花青和部花青)；方酸衍生物和环取代的方酸、包括seta、setau和square染料；萘衍生物(包括丹酰和氟硅酸钠衍生物)；香豆素衍生物；恶二唑衍生物(包括吡啶基恶唑、硝基苯并恶唑和苯并恶二唑)；蒽衍生物(包括蒽醌类、包括draq5、draq7和cytrak橙)；芘衍生物(包括级联蓝等)；恶嗪衍生物(包括尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、恶嗪170等)；吖啶衍生物(包括黄醇黄素、吖啶橙、吖啶黄等)；芳基甲胺衍生物(包括金胺、结晶紫、孔雀石绿)和四吡咯衍生物(卟吩、酞菁、胆红素)。
[0155]
所述d为生色分子，选自以下荧光化合物的任何类似物和衍生物：cf染料、draq和cytrak探针、bodipy、alexafluor、dylightfluor、atto和tracy、fluoprobes、abberiordyes、dy和megastokesdyes、sulfocy染料、hilytefluor、seta、setau和squaredyes、quasar和calfluordyes、surelightdyes(apc、rpepercp、phycobilisomes)、apc、apcxl、rpe、bpe、别藻蓝蛋白(apc)、氨基胭脂蛋白、apc-cy7偶联物、bodipy-fl、cascadeblue、cy2、cy3、cy3.5、cy3b、cy5、cy5.5、cy7、f荧光素、fluorx、羟基香豆素、丽丝胺罗丹明b、萤光黄、me-甲氧基香豆素、nbd、pacificblue、pacificorange、pe-cy5偶联物、pe-cy7偶联物、percp、r-藻红蛋白(pe)、red613、seta-555-叠氮化物、seta-555-dbco、seta-555-nhs、seta-580-nhs、seta-680-nhs、seta-780-nhs、seta-apc-780、seta-percp-680、seta-r-pe-670、setau-380-nhs、setau-405-马来酰亚胺、setau-405-nhs、setau-425-nhs、setau-647-nhs、texasred、tritc、trured、x-rhodamine、7-aad(7-氨基放线菌素d、cg-选择性的)、吖啶橙、色霉素a3、cytrak橙(redexcitationdark)、dapi、draq5、draq7、溴化乙锭、hoechst33258、hoechst33342、lds751、光辉霉素、碘化丙啶(pi)、sytox蓝、sytox绿、sytox橙、噻唑橙、to-pro：菁染料单体、toto-1、to-pro-1、toto-3、to-pro-3、yoseta-1、yoyo-1；荧光化合物：包括dcfh(2'、7'-二氯二氢荧光素、氧化形式)、dhr(二氢罗丹明123、氧化形式、光催化氧化)、fluo-3(am酯，ph》6)、fluo-4(am酯，ph7.2)、indo-1(am酯，低/高钙(ca2+))、snarf(ph6/9)、别藻蓝蛋白(apc)、amcyan1(四聚体、clontech)、asred2(四聚体、clontech)、azamigreen(单体)、azurite、b-藻红蛋白(bpe)、cerulean、cypet、dsred单体(clontech)、dsred2("rfp")、ebfp、ebfp2、ecfp、egfp(弱二聚体)、emerald(弱二聚体)、eyfp(弱二聚体)、gfp(s65a突变)、gfp(s65c突变)、gfp(s65l突变)、gfp(s65t突变)、gfp(y66f突变)、gfp(y66h突变)、gfp(y66w突变)、gfpuv、hcred1、j-red、katusha、kusabiraorange(单体、mbl)、mcfp、mcherry、mcitrine、midoriishicyan(二聚体、mbl)、mkate(tagfp635、单体)、mkeima-red(单体)、mko、morange、mplum、mraspberry、mrfp1(单体)、mstrawberry、mtfp1、mturquoise2、p3(藻胆体复合物)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(percp)、r-phycoerythrin(rpe)、t-sapphire、tagcfp(二聚体)、taggfp(二聚体)、tagrfp(二聚体)、tagyfp(二聚体)、tdtomato(tandem二聚体)、topaz、turbofp602(二聚体)、turbofp635(二聚体)、turbogfp(二聚体)、turborfp(二聚体)、turboyfp(二聚体)、venus、wildtypegfp、ypet、zsgreen1(四聚体)、zsyellow1(四聚体)及其衍生物。
[0156]
所述d为细胞结合配体或受体激动剂，可以选自：叶酸衍生物、谷氨酸尿素衍生物、生长抑素及其类似物(选自奥曲肽(sandostatin)和兰瑞肽(somatuline))、芳香磺酰胺、aromaticsulfonamides、垂体腺苷酸环化酶激活肽(pacap)(pac1)、血管活性肠肽(vip/pacap)(vpac1，vpac2)、α-黑素细胞刺激激素(α-msh)、胆囊收缩素(cck)/胃泌素受体激动剂、蛙皮素(选自pyr-gln-arg-leu-gly-asn-gln-trp-ala-val-gly-his-leu-met-nh2)/胃
泌素释放肽(grp)、神经降压素受体及其受体亚型(ntr1，ntr2，ntr3)、物质p(nk1受体)配体、神经肽y(y1
–
y6)、归巢肽包括rgd(arg-gly-asp)，ngr(asn-gly-arg)，二聚和多聚环状rgd肽(选自crgdfv)，taasgvrsmh和ltlrwvglms(硫酸软骨素蛋白多糖ng2受体)和f3肽、细胞穿透肽(cpps)、肽激素，选自促黄体激素释放激素(lhrh)激动剂和拮抗剂，和促性腺激素释放激素(gnrh)激动剂，通过靶向卵泡刺激素(fsh)和黄体生成素(lh)起作用，以及睾酮产物，选自布舍瑞林(pyr-his-trp-ser-tyr-d-ser(otbu)-leu-arg-pro-nhet)、戈那瑞林(pyr-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly-nh2)、戈舍瑞林(pyr-his-trp-ser-tyr-d-ser(otbu)-leu-arg-pro-azgly-nh2)、组氨瑞林(pyr-his-trp-ser-tyr-d-his(n-苯基)-leu-arg-pro-nhet)、醋酸亮丙瑞林(pyr-his-trp-ser-tyr-d-leu-leu-arg-pro-nhet)、那法瑞林(pyr-his-trp-ser-tyr-2nal-leu-arg-pro-gly-nh2)、曲普瑞林(pyr-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu-arg-pro-gly-nh2)、德舍瑞林、阿巴瑞克(ac-d-2nal-d-4-氯-d-3-(3-吡啶基)ala-ser-(n-me)tyr-d-asn-leu-异丙基-lys-pro-d-ala-nh2)、西曲瑞克(ac-d-2nal-d-4-chloro-phe-d-3-(3-pyridyl)ala-ser-tyr-d-cit-leu-arg-pro-d-ala-nh2)、地加瑞克(ac-d-2nal-d-4-chlorophe-d-3-(3-吡啶基)ala-ser-4-氨基phe(l-hydroorotyl)-d-4-氨基phe(氨基甲酰基)-leu-异丙基lys-pro-d-ala-nh2)和加尼瑞克(ac-d-2nal-d-4-chlorophe-d-3-(3-吡啶基)ala-ser-tyr-d-(n9,n10-二乙基)-homoarg-leu-(n9,n10-二乙基)-homoarg-pro-d-ala-nh2)，模式识别受体(prrs)，选自toll受体(tlrs)、c型凝集素和nodlike受体(nlrs)、降钙素受体激动剂、整合素受体及其受体亚型(选自αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α6β4、α7β1、αlβ2、αiibβ3)激动剂(选自grgdspk，环(rgdfv)(l1)及其衍生物[环(-n(me)r-gdfv)、环(r-sar-dfv)、环(rg-n(me)d-fv)、环(rgd-n(me)f-v)、环(rgdf-n(me)v-)(cilengitide)]、纳米抗体(vhh的衍生物(骆驼ig))、域抗体(dab、vh或vl域的衍生物)、双特异性t细胞engager(bite、双特异性双抗体)、双亲和重新定位(dart，双特异性双抗体)、四价串联抗体(tandab，二聚双特异双抗体)、anticalin(lipocalins的衍生物)、adnectins(10thfn3(fibronectin))、设计的锚蛋白重复蛋白(darpins)、avimers、egf受体和vegf受体激动剂。
[0157]
所述d为上述药物药学上可接受的盐，酸或其衍生物，水合物或水合盐、或晶体结构或任何上述药物的旋光异构体，外消旋物，非对映异构体或对映异构体。
[0158]
优选的，所述的d选自：氨基酸、蛋白质、酶、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、甾体及其甙类和生物碱中的一种。
[0159]
更优选的，所述d为用于杀灭肿瘤细胞的药物；
[0160]
和/或，所述的d优选自：鹅膏菌素、奥瑞他汀、加利车霉素、喜树碱、喜树碱衍生物和代谢物(如：sn-38及其衍生物、10-羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱)，依喜替康、dxd、隐藻霉素、道诺霉素、多拉司他丁、多柔比星、多卡霉素、埃坡霉素、埃斯帕霉素、格尔德霉素、美登素及其衍生物、甲氨蝶呤、单甲基奥瑞他汀e(“mmae”)，单甲基auristatinf(“mmaf”)、吡咯并苯二氮卓、根瘤菌素、sg2285、微管溶素、长春地辛、类毒素、伊立替康、拓扑替康、贝洛替康、依沙替康、卢托替康、二氟替康、吉尼替康、卡尼替康、阿霉素、表柔比星、吗啉代阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉基阿霉素、、mmad、pbd及其衍生物、tpl、紫杉烷、袢霉素、博霉素b及其衍生物、美登素及其衍生物、多拉司他汀、丝裂霉素、氨基蝶呤、放线菌素、博来霉素、n8-乙酰基亚精胺、1-(2-氯乙基)-1,2-二甲磺酰肼、他利霉素、阿糖胞
苷、依托泊苷、紫杉醇、拉霉素、鬼臼毒素、蛇形菌素(anguidine)、长春新碱、长春碱、吗啉-阿霉素、正-(5,5-二乙酰氧基-戊基)阿霉素及其衍生物中的一种或两种以上的组合。
[0161]
在本发明的一些实施例中，所述d选自在本发明的一些实施例中，所述d选自
[0162]
进一步的，所述的缀合物选自：
[0163]
[0164]
[0165]
[0166][0167]
本发明的缀合物属于分支型单分散聚乙二醇连接子-药物缀合物。
[0168]
本发明另一方面还提供前述的缀合物在制备预防和/或治疗疾病药物中的应用，其特征在于，所述的疾病为癌症、炎症、自身免疫疾病。
[0169]
本发明另一方面还提供一种药物组合物包含治疗有效量的前述缀合物及药学上可接受的盐，载体，稀释剂或赋形剂或其组合。
[0170]
所述药物组合物为片剂、栓剂、丸剂、软和硬明胶胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂的剂型。
[0171]
本发明另一方面还提供一种前述缀合物在制备预防和/或治疗疾病药物中的应用，所述药物具有抗癌活性，具体地，所述抗癌活性包括对肠癌、卵巢癌和肺癌具有抑制性的活性。
[0172]
本发明中出现的术语“烷基”可以是直链或支链的烷基，典型的烷基含有1至12(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)个碳原子，即c1-12烷基，例如c1-8烷基，c1-6烷基，c1-3烷基，烷基的实例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、2-乙基丁基、正戊基、异戊基、1-甲基戊基、1,3-二甲基丁基、正己基、1-甲基己基、正庚基、异庚基、1,1,3,3-四甲基丁基、1-甲基庚基、3-甲基庚基、正辛基、2-乙基己基、1,1,3-三甲基己基、1,
1,3,3-四甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基、1-甲基十一烷基、十二烷基、1,1,3,3,5,5-六甲基己基。
[0173]
本发明中出现的术语“亚烷基”可以是直链或支链的烷基，典型的亚烷基含有1至12(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)个碳原子，即c1-12亚烷基，例如c1-18亚烷基，c1-12亚烷基，c1-8亚烷基，c1-6亚烷基，c1-3亚烷基，亚烷基的实例如亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚仲丁基、亚异丁基、2-乙基亚丁基、亚戊基、亚异戊基、1-甲基亚戊基、1,3-二甲基亚丁基、亚己基、1-甲基亚己基、亚庚基、1,1,3,3-四甲基亚丁基、1-甲基亚庚基、3-甲基亚庚基、亚辛基、2-乙基亚己基、1,1,3-三甲基亚己基、1,1,3,3-四甲基亚戊基、亚壬基、亚癸基、亚十一烷基和亚十二烷基的支化和直链的异构体。
[0174]
本发明中出现的术语“环烷基”包括取代环烷基和不饱和环烷基，典型的环烷基含有1至10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个碳原子，即c
1-10
环烷基，例如c3-6环烷基，环烷基的实例如环丙基、环丁基、甲基环丁基、环戊基、甲基环戊基、二甲基环戊基、三甲基环戊基、乙基环戊基、丙基环戊基、异丙基环戊基、环己基、甲基环己基、二甲基环己基、乙基环己基、环庚基、甲基环庚基、环辛基。
[0175]
本发明中，杂环烷基的实例是含有n、o、s、si等元素的环烷基。
[0176]
本发明中的术语芳基包括全碳芳基和杂芳基，其可以被一个或多个c
1-c
12
烷基、卤素、c
3-c8环烷基、c
3-c8环烷氧基、c
1-c
18
烷氧基、芳基取代。
[0177]
本发明中，术语“dmap”是一种超强亲核的酰化作用催化剂，中文名是4-二甲氨基吡啶，它广泛应用于化学合成的新型高效催化剂，有较高的催化能力，对提高收率有极其明显的效果。
[0178]
本发明中，术语“tfa”表示三氟乙酸。
[0179]
本发明中，术语“adc”为antibody-drugconjugate，抗体药物偶联物。抗体药物偶联物adc是具有靶向作用的单克隆抗体与具有特定药理学特性(如细胞毒作用)的化合物的结合，两部分通过连接子偶联为一个整体。
[0180]
本发明中，术语“dar”(drug-to-antibodyratio，药物抗体比值)是抗体药物偶联物的一个关键属性，是adc药物研发过程重要的质控环节。
[0181]
本发明中，术语“mab”为抗体。
[0182]
本发明中，术语“dcm”为二氯甲烷纯溶液。
[0183]
本发明中，术语“acn”为乙腈的纯溶液。
[0184]
本发明中，术语“mpa”为流动相a；
[0185]
本发明中，术语“mpb”为流动相b。
[0186]
本发明中，术语“spr”(spr,surfaceplasmonresonance)，为光学表面等离子共振，可以通过监测生物反应过程中spr角的动态变化，得到生物分子之间结合和相互作用的特异性信号。
[0187]
本发明中，术语“h”代表小时。
[0188]
本发明中，术语“室温”表示25
±
5℃。
[0189]
本发明中，术语“diea”是指n,n-二异丙基乙胺，广泛用作溶剂,用于氨基酸多肽合成等。
[0190]
本发明中，术语“dmf”是指二甲基甲酰胺(dmf)是一种透明液体，常用作溶剂，能和
水及大部分有机溶剂互溶。
[0191]
本发明中，术语“hatu”是一种常用的多肽缩合试剂，应用在羧基与氨基合成肽键的反应之中。其系统命名为2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯，英文名2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-n,n,n',n'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate。
[0192]
本发明中，术语“mmae”是指一甲基澳瑞他汀e简称mmae，是抗有丝分裂剂，能通过阻断微管蛋白的聚合抑制细胞分裂，在抗体偶联药物(adc)中颇受关注。
[0193]
本发明中，术语“kd”是指亲和力常数kd(单位为升/质量摩尔浓度)表示，其计算公式为
[0194]
kd＝[ab
·
h]/([ab][h])
[0195]
其中[]表示摩尔浓度，ab表示抗体，h表示半抗原，ab—h表示抗体与半抗原的结合物
[0196]
亲和力常数kd越高，则抗体结合半抗原的能力越强。抗体亲和力的强弱取决于抗体对位(paratope)与所用抗原表位(epitope)之间的配合程度，包括接触面积的大小、吻合的密切程度、以及带点基团与疏水基团的分布等。
[0197]
本发明的有益效果：
[0198]
(1)本发明提供的分支型聚乙二醇连接子-药物缀合物，可同时偶联两个细胞毒药物，构建双有效载荷抗体偶联药物。连接两种相同的毒素时，可提高载药量，实现构建高dar值抗体偶联药物的目的；连接相同作用机制的不同毒素时，可实现协同作用，提高疗效；连接两种不同作用机制的毒素时，可降低耐药性的发生率。
[0199]
(2)本发明提供的分支型聚乙二醇连接子-药物缀合物，其特定的结构赋予了其高亲水性，提高了其在血液循环中的保留时间；同时，平衡了细胞毒有效载荷的疏水性，缓解了带有疏水性毒素的adc易聚集的问题。
[0200]
(3)本发明提供的分支型聚乙二醇连接子-药物缀合物，与传统抗体药物偶联物相比，制备简单，其dar值分布较窄，产品均一性高。
[0201]
(4)本发明提供的分支型聚乙二醇连接子-药物缀合物，裸抗和低交联度的adc占比几乎为零(质谱检测不出dar为0和1的组份)。
[0202]
(5)本发明提供的分支型聚乙二醇连接子-药物缀合物，偶联后乙二醇所赋予的亲水性可以用来调节生物分子特性，在治疗肿瘤方面具有一定安全性和有效性。
[0203]
(6)本发明分支型聚乙二醇连接子-药物缀合物的连接子中引入了peg链，增加了细胞毒性药物的溶解性，使adc偶联反应更充分，偶联效率更高。
[0204]
(7)本发明提供的偶联方法，适用于大部分抗体，因此具有广泛的应用前景，具有较快的交联速度，交联反应时间通常在2-4小时以内便可反应完毕。
附图说明
[0205]
图1所示为化合物1的质谱图。
具体实施方式
[0206]
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明
的保护范围领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0207]
本发明实施例中所用试剂均为市面上可以购买到的常规试剂。
[0208]
实施例1化合物1的合成
[0209][0210]
1.化合物1a的合成
[0211]
将原料dbco-nhs(8.0g,19mmol)加入到80mldmf中，在依次加入l-glutanicacid(3.89g,23mmol)和tea(4.0g,39mmol)，反应室温搅拌15h，hplc显示反应完全。反应液用200ml饱和硫酸氢钠溶液和dcm100ml洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到淡黄色固体6.5g(化合物1a)，产率75.5％。
[0212]
msm/z(esi):435.2[m+1]
[0213]
2.化合物1b的合成
[0214]
将化合物1a(6.2g,14.3mmol),加入到60mldcm中，再依次加入nh2-peg8-paome(14.3g,31.3mmol),diea(5.5g,43mmol),hatu(16.3g,43mmol)。将反应体系置于室温下搅拌6h，hplc显示反应完全。反应液用100ml饱和氯化铵洗涤三次，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到粗品15g。粗品用硅胶柱层析纯化(dcm/meoh50/1-20/1)得到淡黄色油状物10.5g(化合物1b)，产率58％。
[0215]
msm/z(esi):1309.7[m+1]
[0216]
3.化合物1c的合成
[0217]
将化合物1b(10g，7mmol)溶于50mlthf中，再加入预先溶解好的50mllioh(1.7g,74mmol)水溶液。反应体系置于室温下搅拌1h，hplc显示反应完全。反应液用100ml饱和硫酸氢钠溶液和dcm100ml洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到淡黄色油状物8.0g(化合物1c)，产率81％。
[0218]
msm/z(esi):1281.6[m+1]
[0219]
4.化合物1d的合成
[0220]
将化合物1c(8.0g,6mmol)加入到80mldmf中，再依次加入vc-pab(4.97g,13mmol),diea(2.4g,18mmol),hatu(7.1g,18mmol)。将反应体系置于室温下搅拌2h，hplc显示反应完全。反应液直接制备纯化。最后得到黄色固体8.5g(化合物1d)，产率68％。
[0221]
msm/z(esi):2004.1[m+1]
[0222]
5.化合物1e的合成
[0223]
将原料sn38(30g，76mmol)加入到300mldcm中，再依次加入diea(14.8g,0.1mol)和tbscl(13.8g,91mmol)，反应室温搅拌5h，tlc显示反应完全。反应液用400ml饱和氯化钠溶液洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到粗品，再用硅胶柱层析纯化(正己烷/ea20/1-8/1)得到白色固体42g(化合物1e)，产率82.3％。
[0224]
msm/z(esi):507.2[m+1]
[0225]
6.化合物1f的合成
[0226]
将化合物1e(10g，14.8mmol)溶于70mldcm中，冰水浴降温至0-5℃，依次加入对硝基氯甲酸苯酯(3.3g，16mmol)和dmap(2.89g，24mmol)，自然至室温搅拌2h，tlc显示反应完全后。分别用饱和硫酸氢钠溶液50ml和nacl50ml洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗品15g。硅胶柱纯化(dcm/ea20/1-1/1)得到黄色固体8g(化合物1f)，产率61.5％。
[0227]
msm/z(esi):672.2[m+1]
[0228]
7.化合物1g的合成
[0229]
将化合物1f(5.6g，8mmol)溶于50mldcm和10mldmso中，再加入化合物1d(8.0g，4mmol)和dmap(1.07g,8.7mmol)，室温下搅拌1h，hplc显示反应完全。向反应体系加入100mldcm和50ml饱和硫酸氢钠水溶液，待其分层后，有机相用50ml饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩后得到13g粗品(化合物1g)。
[0230]
msm/z(esi):1534.7[m/2+1]
[0231]
7.化合物1的合成
[0232]
将上步粗品(化合物1g)溶于thf(80ml)中，再加入1mol/lhcl水溶液(20ml)，室温搅拌3h，hplc显示原料反应完全。反应体系用nahco3饱和水溶液100ml调ph＝7～8，然后用二氯甲烷(100ml)萃取两次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗品。粗品用高压制备系统纯化，最后得到黄色的固体5.1g(化合物1)，产率46％，为化合物1.
[0233]
msm/z(esi):1421.6[m/2+1]
[0234]
实施例2化合物2的合成
[0235][0236]
1.化合物2a的合成
[0237]
将原料dbco-nhs(4.0g,10mmol)加入到40mldmf中，依次加入nh
2-peg
8-pa(4.9g,11mmol)和tea(2.0g,20mmol)，反应室温搅拌15h，hplc显示反应完全。反应液用200ml饱和硫酸氢钠溶液和dcm100ml洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到淡黄色固体5.1g(化合物2a)，产率71％。
[0238]
msm/z(esi):729.4[m+1]
[0239]
2.化合物2b的合成
[0240]
将化合物2a(5.0g,7.0mmol)和n-羟基琥珀酰亚胺(1.0g，8.40mmol)溶于60mldcm中，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1.6g，8.40mmol)，反应室温搅拌4h，得到化合物2b的反应液，直接用于下一步反应。
[0241]
msm/z(esi):826.4[m+1]
[0242]
3.化合物2c的合成
[0243]
将l-glutanicacid(1.2g,8mmol)加入上述得到的化合物2b的反应液中，加入tea(0.8g,8mmol)，室温搅拌15h，hplc显示反应完全。反应液用100ml饱和硫酸氢钠溶液和
dcm60ml洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到淡黄色油状物4.2g(化合物2c)，产率70.2％。
[0244]
msm/z(esi):858.4[m+1]
[0245]
4.化合物2d的合成
[0246]
将化合物2c(4.0g,4.6mmol)加入到40mldmf中，再依次加入vc-pab(3.8g,10mmol),diea(1.9g,14mmol),hatu(5.5g,14mmol)。将反应体系置于室温下搅拌2h，hplc显示反应完全。反应液直接制备纯化。最后得到黄色固体3.9g(化合物2d)，产率54％。
[0247]
msm/z(esi):1580.8[m+1]
[0248]
5.化合物2e的合成
[0249]
将化合物1f(2.8g，4mmol)溶于30mldcm和5mldmso中，再加入化合物2d(3.2g，2mmol)和dmap(0.5g,4.4mmol)，室温下搅拌2h，hplc显示反应完全。将反应体系加入50mldcm和50ml饱和硫酸氢钠水溶液，有机相用50ml饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩后得到2.6g粗品。
[0250]
msm/z(esi):1323.1[m/2+1]
[0251]
6.化合物2的合成
[0252]
将上步粗品溶于thf(20ml)中，再加入1mol/lhcl水溶液(5ml)，室温搅拌3h，hplc显示原料反应完全。反应体系用nahco3饱和水溶液调ph＝7～8，然后用二氯甲烷(100ml)萃取两次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗品。粗品用高压制备系统纯化，最后得到黄色固体1.2g(化合物2)，产率48％。
[0253]
msm/z(esi):1209.0[m/2+1]
[0254]
实施例3化合物3的合成
[0255][0256]
1.化合物3a的合成
[0257]
将原料dbco-nhs(8.0g,19mmol)加入到80mldmf中，在依次加入l-glutanicacid
(3.89g,23mmol)和tea(4.0g,39mmol)，反应室温搅拌15h，hplc显示反应完全。反应液用200ml饱和硫酸氢钠溶液和dcm100ml洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到淡黄色固体6.5g(化合物3a)，产率75.5％。
[0258]
msm/z(esi):435.2[m+1]
[0259]
2.化合物3b的合成
[0260]
将化合物3a(6.2g,14.3mmol),加入到60mldcm中，再依次加入nh
2-peg
8-paome(14.3g,31.3mmol),diea(5.5g,43mmol),hatu(16.3g,43mmol)。将反应体系置于室温下搅拌6h，hplc显示反应完全。反应液用100ml饱和氯化铵洗涤三次，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到粗品15g。粗品用硅胶柱层析纯化(dcm/meoh50/1-20/1)得到淡黄色油状物10.5g(化合物3b)，产率58％。
[0261]
msm/z(esi):1309.7[m+1]
[0262]
3.化合物3c的合成
[0263]
将化合物3b(10g，7mmol)溶于50mlthf中，再加入预先溶解好的50mllioh(1.7g,74mmol)水溶液。反应体系置于室温下搅拌1h，hplc显示反应完全。反应液用100ml饱和硫酸氢钠溶液和dcm100ml洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到淡黄色油状物8.0g(化合物3c)，产率81％。
[0264]
msm/z(esi):1281.6[m+1]
[0265]
4.化合物3d的合成
[0266]
将化合物3c(8.0g,6mmol)加入到80mldmf中，再依次加入vc-pab(4.97g,13mmol),diea(2.4g,18mmol),hatu(7.1g,18mmol)。将反应体系置于室温下搅拌2h，hplc显示反应完全。反应液直接制备纯化。最后得到黄色固体8.5g(化合物3d)，产率68％。
[0267]
msm/z(esi):2004.1[m+1]
[0268]
6.化合物3的合成
[0269]
将化合物3d(8g，4mmol)溶于50mldcm中，冰水浴降温至0-5℃，依次加入对硝基氯甲酸苯酯(2.1g，10mmol)和dmap(1.9g，16mmol)，室温搅拌2h，tlc显示反应完全后,加入mmae(6.5g，9mmol)和dmap(1.1g，9mmol)。分别用饱和硫酸氢钠溶液50ml和nacl50ml洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩有机相得到粗品。经硅胶柱层析高压制备分离得到黄色固体4.7g(化合物3)，产率34％。
[0270]
msm/z(esi):1746[m/2+1]
[0271]
实施例4化合物4的合成
[0272][0273]
1.化合物4a的合成
[0274]
将原料dbco-nhs(8.0g,19mmol)加入到80mldmf中，在依次加入l-glutanicacid(3.89g,23mmol)和tea(4.0g,39mmol)，反应室温搅拌15h，hplc显示反应完全。反应液用200ml饱和硫酸氢钠溶液和dcm100ml洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到淡黄色固体6.5g(化合物4a)，产率75.5％。
[0275]
msm/z(esi):435.2[m+1]
[0276]
2.化合物4b的合成
[0277]
将化合物4a(6.2g,14.3mmol),加入到60mldcm中，再依次加入nh
2-peg
8-paome(14.3g,31.3mmol),diea(5.5g,43mmol),hatu(16.3g,43mmol)。将反应体系置于室温下搅拌6h，hplc显示反应完全。反应液用100ml饱和氯化铵洗涤三次，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到粗品15g。粗品用硅胶柱层析纯化(dcm/
meoh50/1-20/1)得到淡黄色油状物10.5g(化合物4b)，产率58％。
[0278]
msm/z(esi):1309.7[m+1]
[0279]
3.化合物4c的合成
[0280]
将化合物4b(10g，7mmol)溶于50mlthf中，再加入预先溶解好的50mllioh(1.7g,74mmol)水溶液。反应体系置于室温下搅拌1h，hplc显示反应完全。反应液用100ml饱和硫酸氢钠溶液和dcm100ml洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到淡黄色油状物8.0g(化合物4c)，产率81％。
[0281]
msm/z(esi):1281.6[m+1]
[0282]
4.化合物4d的合成
[0283]
将化合物4c(8.0g,6mmol)加入到80mldmf中，再依次加入vc-pab(4.97g,13mmol),diea(2.4g,18mmol),hatu(7.1g,18mmol)。将反应体系置于室温下搅拌2h，hplc显示反应完全，得到反应液。将前述反应液直接制备纯化。最后得到黄色固体8.5g(化合物4d)，产率68％。
[0284]
msm/z(esi):2004.1[m+1]
[0285]
5.化合物4e的合成
[0286]
将化合物4d(8g，4mmol)溶于50mldcm中，冰水浴降温至0-5℃，依次加入对硝基氯甲酸苯酯(2.1g，10mmol)和dmap(1.9g，16mmol)，室温搅拌2h，tlc显示反应完全后，分别用饱和硫酸氢钠溶液50ml和nacl50ml洗涤一次，使反应体系分层，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗品6.0g(化合物4e)，产率65％。
[0287]
msm/z(esi):1167.5[m/2+1]
[0288]
6.化合物4f的合成
[0289]
将化合物4e(4.6g，2mmol)溶于20mldcm和5mldmso中，再加入化合物sn38-otbs(0.5g，1mmol)和dmap(0.2g,1.5mmol)，室温下搅拌2h，hplc显示反应完全。将反应体系加入50mldcm和50ml饱和硫酸氢钠水溶液，使反应体系分层，有机相用50ml饱和氯化钠溶液洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩后得到粗品，经高压制备分离得到黄色固体1.6g(化合物4f)，产率61％。
[0290]
msm/z(esi):1351.2[m/2+1]
[0291]
7.化合物4g的合成
[0292]
将化合物4f(1.3g，0.5mmol)溶于10mldcm中，再加入化合物mmae(0.4g，0.6mmol)和dmap(0.1g,1.0mmol)，室温下搅拌2h，hplc显示反应完全。将反应体系加入20mldcm和20ml饱和硫酸氢钠水溶液，使反应体系分层，有机相用20ml饱和氯化钠溶液洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩后得到粗品，经高压制备分离得到黄色固体1.6g(化合物4g)，产率70％。
[0293]
msm/z(esi):1640.4[m/2+1]
[0294]
8.化合物4的合成
[0295]
将化合物4g(1.5g,0.46mmol)溶于thf(10ml)中，再加入1mol/lhcl水溶液(3ml)，室温搅拌3h，hplc显示原料反应完全。反应体系用nahco3饱和水溶液调ph＝7～8，然后用二氯甲烷(100ml)萃取两次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗品。粗品用高压制备纯化，最后得到黄色固体700mg(化合物4)，产率48％。
[0296]
msm/z(esi):1583.4[m/2+1]
[0297]
实施例5化合物5的合成
[0298][0299]
1.化合物5a的合成
[0300]
将原料dbco-nhs(8.0g,19mmol)加入到80mldmf中，在依次加入l-glutanicacid(3.89g,23mmol)和tea(4.0g,39mmol)，反应室温搅拌15h，hplc显示反应完全。反应液用200ml饱和硫酸氢钠溶液和dcm100ml洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到淡黄色固体6.5g(化合物5a)，产率75.5％。
[0301]
msm/z(esi):435.2[m+1]
[0302]
2.化合物5b的合成
[0303]
将化合物5a(6.2g,14.3mmol),加入到60mldcm中，再依次加入nh2-peg8-paome(14.3g,31.3mmol),diea(5.5g,43mmol),hatu(16.3g,43mmol)。将反应体系置于室温下搅拌6h，hplc显示反应完全。反应液用100ml饱和氯化铵洗涤三次，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到粗品15g。粗品用硅胶柱层析纯化(dcm/meoh50/1-20/1)得到淡黄色油状物10.5g(化合物5b)，产率58％。
[0304]
msm/z(esi):1309.7[m+1]
[0305]
3.化合物5c的合成
[0306]
将化合物5b(10g，7mmol)溶于50mlthf中，再加入预先溶解好的50mllioh(1.7g,74mmol)水溶液。反应体系置于室温下搅拌1h，hplc显示反应完全。反应液用100ml饱和硫酸氢钠溶液和dcm100ml洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到淡黄色油状物8.0g(化合物5c)，产率81％。
[0307]
msm/z(esi):1281.6[m+1]
[0308]
4.化合物5d的合成
[0309]
将化合物5c(8.0g,6mmol)加入到80mldmf中，再依次加入vc-pab(4.97g,13mmol),diea(2.4g,18mmol),hatu(7.1g,18mmol)。将反应体系置于室温下搅拌2h，hplc显示反应完全。反应液直接经高压制备系统纯化。最后得到黄色固体8.5g(.化合物5d)，产率68％。
[0310]
msm/z(esi):2004.1[m+1]
[0311]
5.化合物5e的合成
[0312]
将化合物5d(8g，4mmol)溶于50mldcm中，冰水浴降温至0-5℃，依次加入对硝基氯甲酸苯酯(2.1g，10mmol)和dmap(1.9g，16mmol)，室温搅拌2h，tlc显示反应完全后，分别用饱和硫酸氢钠溶液50ml和饱氯化钠溶液50ml洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗品6.0g(化合物5e)，产率65％。
[0313]
msm/z(esi):1167.5[m/2+1]
[0314]
6.化合物5f的合成
[0315]
将化合物5e(4.6g，2mmol)溶于20mldcm和5mldmso中，再加入化合物mmae(0.7g，1mmol)和dmap(0.2g,1.5mmol)，室温下搅拌2h，hplc显示反应完全。将反应体系加入50mldcm和50ml饱和硫酸氢钠水溶液，有机相用50ml饱和氯化钠溶液洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩后得到粗品，经高压制备分离得到黄色固体1.9g(化合物5f)，产率65％。
[0316]
msm/z(esi):1456.8[m/2+1]
[0317]
7.化合物5g的合成
[0318]
将sn38(5.5g，14mmol)(购自湖北信康，≥95％)溶于50mldcm中，冰水浴降温至0-5℃，依次加入对硝基氯甲酸苯酯(3.3g，16mmol)和dmap(2.89g，24mmol)，自然至室温搅拌2h，tlc显示反应完全后。分别用饱和硫酸氢钠溶液50ml和nacl50ml洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗品15g。硅胶柱纯化(dcm/ea20/1-1/1)得到黄色固体4.6g(化合物5g)，产率60％。
[0319]
msm/z(esi):558.1[m+1]
[0320]
8.化合物5h的合成
[0321]
将化合物5g(4.5g，8mmol)溶于30mldcm和5mldmso中，再加入n,n'-二甲基乙二胺(0.8g，9.0mmol)和dmap(1.07g,8.7mmol)，室温下搅拌1h，hplc显示反应完全。将反应体系加入100mldcm和50ml饱和硫酸氢钠水溶液，有机相用50ml饱和氯化钠溶液洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离得到黄色固体2.3g(化合物5h)，产率58％。
[0322]
msm/z(esi):507.2[m+1]
[0323]
9.化合物5的合成
[0324]
将化合物5f(1.4g，0.5mmol)溶于10mldcm和2mldmso中，再加入化合物5h(0.3g,0.6mmol)和dmap(0.1g,1.0mmol)，室温下搅拌2h，hplc显示反应完全。将反应体系加入
20mldcm和20ml饱和硫酸氢钠水溶液，有机相用20ml饱和氯化钠溶液洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩后得到粗品，经高压制备分离得到黄色固体700mg(化合物5)，产率47％。
[0325]
msm/z(esi):1554.3[m/2+1]
[0326]
实施例6 adc的制备
[0327]
6.1 mab与peg12反应过程
[0328]
按照mab与n
3-peg12-spa的摩尔比为1:20的投料比进行反应。先量取208μl的mab溶液(浓度：9.6mg/ml)置于1.5ml的离心管中，则量取的mab为2mg。使用5mmph3.0的pbs溶液配制10mg/ml的n
3-peg12-spa溶液，量取20μl加入到离心管中，充分混合，震荡反应2h。反应完毕后用超滤的方式去除未反应的n
3-peg12-spa。
[0329]
mab为egfr单抗-耐昔妥珠单抗(necitumumab)，购自礼来(elililly)公司
[0330]n3-peg12-spa为自制，纯度95％，msm/z(esi):741.4[m+1]。
[0331]
6.2 mab-peg12与linker-drug反应过程
[0332]
取制备好的mab-peg12样品，测定蛋白浓度为2.05mg/ml，量取490μl样品溶液置于1.5ml的离心管中。称量10mg linker-drug，溶解在dmso中，制备成1mg/ml的溶液。按照mab与linker-drug投料比为1:4计算，量取41μl linker-drug溶液加入到离心管中，再向离心管中加入510μl的pbs和59μl的dmso，保持蛋白浓度为1mg/ml，水与dmso的比例为10:1，充分混合，震荡反应2h。反应完毕后用超滤的方式去除未反应的小分子，得到adc分子，如下表所示。
[0333]
表1 linker-drug的种类以及对应的adc分子的名称
[0334]
linker-drugadc分子化合物1adc1化合物4adc2dbco-vc-pab-sn38adc3
[0335]
其中，化合物1为实施例1制备，化合物4为实施例4制备，dbco-vc-pab-sn38，为自制，纯度90％，msm/z(esi):1087.4[m+1]
[0336]
dbco-vc-pab-sn38结构式如下图所示：
[0337][0338]
实施例7 dar值的测量
[0339]
用液相色谱方法检测实施例6中的adc的dar值。
[0340]
液相色谱设置如下：
[0341]
表2液相色谱条件
[0342][0343]
溶解实施例6制备的adc1、adc2、adc3，按照表2中的液相色谱条件对adc1、adc2、adc3进行检测，该液相色谱条件下sn38与adc1、adc2、adc3分离度大于1.5。制备不同浓度标准曲线，建立sn38峰面积与浓度之间的线性标准曲线，分别对adc1、adc2和adc3上的sn38进行定量。根据adc的抗体浓度和sn38的浓度计算adc上sn38的偶联个数。测定实施例6制备的adc1的dar值为8，adc2的dar值为8，adc3的dar值为4，adc1和adc2的dar值高于adc3，实验结果表明，相较于传统该发明获得的adc1和adc2的dar值更高。
[0344]
实施例8 adc与egfr的亲和力测定
[0345]
adc药物的亲和力用spr的方法进行检测，试验仪器为ge公司的产品biacore。
[0346]
简单操作步骤为：将egfr抗原偶联到cm芯片上。用不同浓度的adc药物或单抗药物测试adc药物的抗体或游离的抗体与抗原的亲和力。
[0347]
结果显示实施例6制备的adc1、adc2和adc3，其抗体的亲和力下降不是很明显，adc1和adc2的亲和力高于adc3。
[0348]
表3实验结果：
[0349]
analytekdmab0.287nmadc10.435nmadc20.397nmadc30.542nm
[0350]
实施例9体外细胞毒性实验
[0351]
用bxpc-3(人胰腺癌细胞)细胞进行体外细胞毒性测试。试验操作如下：
[0352]
1、96孔板每孔加入细胞100μl(留2个空白组不加细胞，加入同体积的培养基)。细胞置于37℃的5％co2细胞培养箱中培养24h。细胞毒性实验每孔加入100μl约含10000个细胞。
[0353]
2、每孔加入10μl不同浓度adc或sn38的药物。
[0354]
3、将96孔板在37℃，含5％co2空气及100％湿度的细胞培养箱中孵育24小时。
[0355]
4、每孔加入10μl的cck-8溶液。37℃，5％co2培养箱中孵育3h。
[0356]
5、酶标仪测定450nm处的吸光度。
[0357]
6、结果分析：
[0358]
a.细胞存活率：将各测试孔的od值减去本底od值(空白组)，各重复孔的od值取平
均数
±
sd。
[0359]
细胞存活率％＝(加药细胞od/对照细胞od)
×
100％。
[0360]
b.求出t/c＝50％时的药物浓度(ic50)及t/c＝10％时的药物浓度(ic90)。
[0361]
结果显示实施例6制备的adc1的ic50值小于adc2的ic50值，均小于sn38的ic50值。
[0362]
表4细胞毒性结果：
[0363]
药物分子ic50adc10.097nmadc20.083nmadc30.267nmfreesn380.072μm
[0364]
结果表明，该发明获得的adc1和adc2不仅能够有效地发挥egfr抗体部分的生物学功能，还兼有sn38对肿瘤细胞的高效杀伤活性。相较于传统的直线型linker制备得到的adc3，本发明得到的具有分支型linker的adc1和adc2具有更优的活性。
[0365]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。