具有抗乙型肝炎病毒功能的德氏乳杆菌Q80和短乳杆菌SR52-2及其应用的制作方法

acid，scfa)还能促进gm中有益scfa产生菌的生长。已知scfa调节抗炎反应，调节细胞分化和增殖；还可通过限制肠道细菌及其代谢产物进入肝脏来保护肠道上皮功能，防止细菌内毒素血症，如增加杯状细胞粘液分泌和释放抗菌肽的能力保护肠道上皮免受病原菌的影响。通过喂食scfa的hbx转基因(hbxtg)小鼠研究证实，scfa促进肿瘤抑制因子、失能同源蛋白2的表达增加，还以剂量依赖性的方式降低hbx转染细胞系的细胞活力，且人的原代肝细胞活力不受此影响，这有效延缓慢性肝病的发病进程。另外有学者发现青春双岐杆菌(bifidobacterium adolescentis)spm0212的细胞提取物以剂量依赖性降低细胞外hbsag水平达50％，其基因表达也被抑制40％，同时显著提高ifn诱导的抗粘液病毒a(myxovirus resistance a)的表达水平。随着对乳酸菌研究日渐深入，全球许多国家已经在医药、食品、日用品、畜牧业等多个领域广泛运用，其相关产品更是琳琅满目。但是，乳酸菌的抗病毒研究和应用起步较晚，尤其是我国，且市面上的抗病毒乳酸菌产品仍然一片空白，真正投入应用并不多。因此，定向筛选对hbv具有抗病毒作用的功能性乳酸菌并且进行深入的抗hbv机制研究和相关产品开发具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供具有抗hbv功能的德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaicus)q80(简称q80，下同)和短乳杆菌(levilactobacillus brevis)sr52-2(简称sr52-2，下同)及其应用，本发明的乳酸菌在动物体内有很好的抑制hbv dna复制的作用，在人体内抗hbv方面具有巨大的潜力。
6.本发明的第二个目的是提供德氏乳杆菌保加利亚亚种q80或短乳杆菌sr52-2在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用或抗菌药物中的应用。也可以用于食品或保健品中。
7.所述的抗菌药物是抗小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、椰毒假单胞菌或溶血葡萄球菌药物。
8.本发明的第三个目的是提供一种抗乙型肝炎病毒药物或抗菌药物，其含有德氏乳杆菌保加利亚亚种q80或短乳杆菌sr52-2、或其培养物或其发酵液或其加工物作为活性成分。
9.所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种q80或短乳杆菌sr52-2其可以用mrs培养基作为培养基。
10.本发明的第四个目的是提供用于鉴定德氏乳杆菌保加利亚亚种q80的特异分子靶标，其核苷酸序列如seq id no.1所示，还提供了用于鉴定短乳杆菌sr52-2的特异分子靶标，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.本发明的第五个目的是提供检测上述的特异性分子靶标的引物组。
12.优选，针对德氏乳杆菌保加利亚亚种q80，其引物组为：forward primer：gatcgtaca tgccttccggt，reverse primer：aagcccatctgccagtacac；针对短乳杆菌sr52-2，其引物组为：forward primer：agcggtggacagaataaagca；reverse primer：tccaa gcgttcaaattgggg。
13.本发明的第五个目的是提供一种德氏乳杆菌保加利亚亚种q80或短乳杆菌sr52-2的鉴定方法，其包括如下步骤：
14.s1：使用上述引物组进行pcr扩增；
15.s2：进行凝胶电泳检测扩增产物；
16.s3：观察扩增产物是否符合预期。
17.优选的，所述s1中的pcr扩增体系包括2
×
pcr mix、模板dna、引物组和灭菌双蒸水。
18.优选的，所述pcr扩增体系为2
×
taq pcr mastermix 10μl，乳酸菌模板dna 1μl，引物各1.0μmol(终浓度)，rnase-free water补足体系的体积至20μl。
19.优选的，所述s1中的德氏乳杆菌保加利亚亚种q80株菌的pcr扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s；64℃退火30s；72℃延伸30s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10min。
20.优选的，所述s1中的短乳杆菌sr52-2株菌的pcr扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s；68.1℃退火30s；72℃延伸30s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10min。
21.本发明经过筛选得到两株具有抗hbv功能的乳酸菌，分别命名为德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaicus)q80和短乳杆菌(levilactobacillus brevis)sr52-2。经体内外试验证明，该两株乳酸菌体内外均具有抑制hbv dna复制的能力，同时具备胃肠道消化耐受能力及较好的益生特性，并且无溶血性以及对多种抗生素敏感；通过16s rrna基因序列比对分析，q80菌株鉴定为德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaicus)，sr52-2菌株鉴定为短乳杆菌(levilactobacillus brevis)sr52-2。
22.本发明提供所述乳酸菌在制备用于抗hbv的医药组合物中的应用。
23.本发明提供所述乳酸菌在制备抗hbv或防控致病菌的食品中的应用。
24.本发明提供一种包含任一所述的乳酸菌的培养物或其加工物。
25.本发明提供一种医药组合物，包括所述乳酸菌、所述的培养物或其加工物。
26.本发明还提供一种食品、保健品组合物，包括所述乳酸菌、所述的培养物或其加工物。
27.本发明的有益效果：
28.本发明提供的乳酸菌均分离自传统腌制食品的菌株。在体外能够抑制hbv dna的复制与hbeag和hbsag的产生；同时对胃肠道环境耐受，且安全性能较好；并能在体内抑制hbv dna的复制与hbeag和hbsag的产生，还可以延缓荷瘤裸鼠肿瘤的发生。本发明所筛选提供的乳酸菌q80和sr52-2均同时具备益生菌良好的益生特性和安全性，且在体内外的功能显著，这在开发预防和治疗hbv感染及其相关性疾病等功能食品或药品方面具有较大的应用潜力和利用价值。
29.lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaicus q80于2022年03月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmcc no：62325，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070。
30.levilactobacillus brevis sr52-2于2022年07月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmcc no：62608，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070。
附图说明
31.图1：q80和sr52-2的16s rrna基因系统发育树。
32.图2：q80和sr52-2的体外实验；其中，(a)细胞活性(各柱子从左至右组别分别为control、mrs、lam、q80、其它德氏乳杆菌分离株ld5、其它德氏乳杆菌分离株ld6、sr52-2、其它短乳杆菌分离株lb2和其它短乳杆菌分离株lb3)；(b)胞外hbv dna表达水平(各柱子从左至右组别分别为control、mrs、lam、q80、ld5、ld6、sr52-2、lb2和lb3)；(c)胞外hbeag表达水平(各柱子从左至右组别分别为control、mrs、lam、q80、ld5、ld6、sr52-2、lb2和lb3)；(d)胞外hbsag表达水平(各柱子从左至右组别分别为control、mrs、lam、q80、ld5、ld6、sr52-2、lb2和lb3)；其中，与control组相比的差异性，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001。
33.图3：q80和sr52-2的益生特性；其中，(a)q80和sr52-2的胃液耐受性(3组柱子，每组柱子从左至右均分别为q80、sr52-2)；(b)q80和sr52-2的肠液耐受性(3组柱子，每组柱子从左至右均分别为q80、sr52-2)；(c)乳酸菌的聚集性(3组柱子，每组柱子从左至右均分别为q80、sr52-2)；(d)乳酸菌的疏水性(2组柱子，每组柱子从左至右均分别为q80、o157：h7、q80+o157：h7、sr52-2、sr52-2+o157)；其中，q80+o157：h7表示q80和o157：h7的共聚集，sr52-2。
34.图4：q80和sr52-2的溶血实验。
35.图5：q80和sr52-2的体内实验。其中，(a)荷瘤裸鼠体重变化；(b)裸鼠荷瘤体积变化；(c)荷瘤重量；(d)肝脏hbv dna表达水平(各柱子从左至右组别分别为m+ns、m+lam、m+q80、m+lam+q80、m+sr52-2和m+lam+sr52-2)；(e)血清hbv dna水平(各柱子从左至右组别分别为m+ns、m+lam、m+q80、m+lam+q80、m+sr52-2和m+lam+sr52-2)；(f)血清hbeag表达水平(各柱子从左至右组别分别为m+ns、m+lam、m+q80、m+lam+q80、m+sr52-2和m+lam+sr52-2；(g)血清hbsag表达水(各柱子从左至右组别分别为m+ns、m+lam、m+q80、m+lam+q80、m+sr52-2和m+lam+sr52-2，其中，con：对照；m：model；ns：生理盐水(normal saline，ns)；lam：拉米夫定(lamivudine，lam)；与健康对照组(con+ns)相比较的差异性，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001；与模型对照组相比较的差异性，
#
表示p《0.05，
##
表示p《0.01，
###
表示p《0.0001；与药物预防组(m+lam)相比较的差异性，
+
表示p《0.05，
++
表示p《0.01，
+++
表示p《0.0001。
36.图6：q80的特异分子靶标验证电泳图；m表示maker，100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp。
37.图7：sr52-2的特异分子靶标验证电泳图；m表示maker，100bp，200bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp。
38.图8：q80实时荧光定量pcr图；(a)表示q80标准曲线图；(b)表示q80扩增曲线图(曲线从左至右拷贝数分别是10
10
～104)。
39.图9：sr52-2实时荧光定量pcr图；(a)表示sr52-2标准曲线图；(b)表示sr52-2扩增曲线图(曲线从左至右拷贝数分别是10
10
～105)。
具体实施方式
40.为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用
microbial，中国)培养液稀释的不同浓度的乳酸菌发酵上清液100μl，轻振荡培养板以混匀。空白组仅加100μl纯dmem。每个组别分别重复3个孔。置于37℃、5％co2条件下分别培养24～96h。之后加入10μl cck-8试剂，在37℃孵育2h后于测a450 nm。实验进行三次重复。
[0054][0055]
式中，s1表示细胞存活率(％)；
[0056]
as表示实验孔吸光度(含有细胞，培养基，cck-8和待测化合物的孔的吸光度)；
[0057]
ab表示空白孔吸光度(含有培养基和cck-8的孔的吸光度)；
[0058]
ac表示对照孔吸光度(含有细胞，培养基和cck-8的孔的吸光度)。
[0059]
乳酸菌发酵上清液对hepg2.2.15细胞的细胞毒性实验结果如图2a所示，选择细胞活性100％
±
5％范围的乳酸菌发酵液浓度，建立其对细胞的最大安全浓度为后续实验基础，以排除因药物或发酵液对细胞产生的毒害作用而影响对hbv dna的监测结果。
[0060]
(4)抗hbv性能测定
[0061]
hepg2.2.15细胞以1
×
105cells/ml接种于24孔板，每孔1ml，培养24h，弃培养液。在无毒浓度下分别加入乳酸菌发酵液上清(最大安全稀释浓度)100μl，每浓度设置3个平行孔，同时设dmem培养基的细胞阴性对照组、lam(125μg/ml)的阳性对照组、mrs对照组(以排除mrs对hbv的影响)各3孔。继续培养至24～96h，收集培养液，用rt-qpcr检测hbv dna的表达水平。实验进行三次重复。
[0062]
rt-qpcr采用引物分别为正向引物forward primer：5
’‑
ggccatcagcgcatgc-3’，反向引物reverse primer：5
’‑
cgctgcgagcaaaaca-3’，探针引物probe primers：5
’‑
r-ctc tgccgatccatactgcggaactc-q-3’。rt-qpcr反应体系为：2
×
probe qpcr supermix(huankai microbial，中国)10μl，forward primer与reverse primer终浓度均为0.2～10μmol/l，probe primers(10μmol/l)0.4μl，rox reference dye(需根据机器型号选择)0.4μl，rnase-free water补齐体积至20μl。反应程序为：50℃，2min；94℃，2mi n；94℃15s，60℃20s，72℃30s，45个循环。
[0063]
采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，elisa)测定hbeag、hbsag含量。
[0064]
在临床上，根据hbv dna、hbeag和/或hbsag的水平高低判断hbv感染传染性强弱及评估hbv相关疾病的疾病预后情况。而本发明的体外结果如图2b-d所示，本发明提供的乳酸菌的体外实验中，如图2b所示，与对照组相比，q80和sr52-2处理组的胞外hbv dna相对表达水平分别为64.54％
±
3.06％(p《0.01)和58.23％
±
4.93％(p《0.01)；如图2c所示，hbeag的胞外表达量分别71.3
±
2.75iu/l(p《0.01)和67.45
±
1.55iu/l(p《0.01)；如图2d所示，hbsag的胞外表达量分别为6.30
±
0.49mg/l(p《0.01)和7.18
±
0.11mg/l(p《0.01)。这表明q80和sr52-2能在一定程度上抑制hbv dna的复制和hbeag与hbsag的表达，其在抗病毒功能的应用值得深入研究。
[0065]
实施例3乳酸菌的益生特性评价
[0066]
(1)人工胃液、肠液耐受性能测定
[0067]
将活化后的乳酸菌q80和sr52-2分别按体积比2％的接种量接种接入到无菌的mrs液体培养基中，于37℃厌氧条件下培养48h，培养液经3,000r/min离心10min收集菌体，用灭
菌生理盐水重悬洗涤离心2次并制成菌液浓度为1
×
108cfu/ml的菌悬液。然后，将1ml菌悬液接种于9ml过滤除菌处理的ph 3.0的人工胃液试管中，充分混匀后37℃厌氧培养。并在实验开始0h和保温3h、5h后分别取样，测定其活菌数。然后无菌吸取1ml经3h和5h处理后的含菌人工胃液，接种于9ml过滤除菌的ph 8.0的人工肠液中，继续置37℃恒温箱厌氧培养，在5h后取样测定活菌数。每个实验进行三次重复。
[0068]
配制人工模拟胃液：用灭菌后的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，pbs，ph7.2)将胃蛋白酶(1：10000)配制成浓度为3mg/ml的胃蛋白酶溶液，用1mol/l盐酸溶液调节ph值至3.0，而后经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。
[0069]
配制人工模拟肠液：用灭菌后的pbs(ph7.2)将胰蛋白酶(1：250)配制成浓度为1mg/ml溶液，再加入0.3％的牛胆盐，并用1mol/l氢氧化钠调节ph值至8.0，而后经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。
[0070]
计算公式如下：
[0071][0072]
式中，s2表示乳酸菌的存活率(％)；
[0073]nt
表示处理3h或5h后乳酸菌的活菌数(cfu)；
[0074]
n0表示处理0h时乳酸菌的活菌数(cfu)。
[0075]
对所筛选菌株进行模拟人工胃液、肠液模拟实验，结果如图3a-b所示，经过胃液和肠液处理5h后，q80的存活率分别为31.84％和49.39％，sr52-2的存活率分别为74.84％和87.91％，这表明本发明提供的乳酸菌具有一定的胃肠液耐受能力，能够在胃肠道中存活并发挥作用。
[0076]
(2)乳酸菌疏水率测定
[0077]
将活化后的乳酸菌按2％的接种量接种接入到无菌的mrs液体培养基中，于37℃厌氧条件下培养48h，取1ml乳酸菌的菌悬液，3,000r/min离心10min，吸去上清液，用无菌pbs(ph 7.2)洗涤2遍。将乳酸菌悬液od
595nm
调整为0.8～1.0。3ml乳酸菌悬液中分别加入1ml有机溶剂二氯甲烷(dichloromethane)、乙醚(diethyl ether)和二甲苯(xylene)，在37℃反应10min，进行温度平衡，振荡混匀，在37℃培养3h，测定水相溶液od
595nm
。实验进行三次重复。乳酸菌的疏水性按如下式计算：
[0078][0079]
式中，h表示乳酸菌的疏水率(％)；
[0080]
g0和g
t
分别表示乳酸菌与有机溶剂(二氯甲烷、乙醚和二甲苯)混匀前、后菌液的od
595nm
值；
[0081]
乳酸菌的疏水性是决定其非特异性黏附到各种生物、非生物表面及界面的最重要的因素之一，也是影响细菌吸收和降解疏水性有机物质的主要影响因素之一，乳酸菌的高度疏水性有利于菌株在肠道中存活，维持肠道菌群稳态。对所筛选出菌株进行疏水率测定，结果如图3c所示，q80对二氯甲烷、乙醚和二甲苯的疏水率分别为29.44％、24.57％、29.33％；sr52-2表现出高疏水性，其疏水率分别76.60％、50.95％、65.23％。
[0082]
(3)乳酸菌的聚集性能测定
[0083]
自聚集：将活化后的乳酸菌按2％的接种量接种接入到无菌的mrs液体培养基中，于37℃厌氧条件下培养48h，取1ml乳酸菌的菌悬液，3,000r/min离心10min，吸去上清液，用无菌pbs洗涤2遍，向菌体中加入3ml无菌pbs，经涡旋混合10s，混匀后取200μl菌液测定其于600nm下的吸光值，之后将菌悬液室温下放置2、4、6h后，再进行重复实验测定a
t
。实验进行三次重复。按下式计算乳酸菌自聚集百分率：
[0084][0085]
式中，s3表示乳酸菌的自聚合能力(％)；
[0086]
a0表示乳酸菌0h的吸光值；
[0087]
at表示乳酸菌不同时间t(2、6h)的吸光值。
[0088]
共聚集：以肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic escherichia coli)o157：h7对乳酸菌的共聚集能力进行评价。将等体积的乳酸菌和致病菌悬液混合，涡旋振荡10s，在37℃下孵育2、6h后，轻取200μl上层悬液，测量600nm处的吸光值。实验进行三次重复。按下式计算乳酸菌共聚集百分率：
[0089][0090]
式中，s4表示乳酸菌的共聚集能力(％)；
[0091]ap
表示乳酸菌的初始吸光值；
[0092]ae
表示致病菌o157：h7的初始吸光值；
[0093]amix
表示乳酸菌和致病菌o157：h7混合菌悬液培养2、6h后的吸光值。
[0094]
乳酸菌的疏水性、自凝聚能力与微生物的生物膜形成能力呈现正相关的关系，其可体现菌株黏附与定植能力。本发明分别测定2、6h菌株聚集率，结果如图3d所示，随着时间推移，乳酸菌的自聚集率和共聚集率菌呈现上升趋势，q80和sr52-2的自聚集率在6h时分别能达到40％和79.73％，同时对肠出血性大肠杆菌一定程度的拮抗作用，这明在肠道中本发明提供的乳酸菌能有效拮抗致病菌。
[0095]
(4)乳酸菌发酵上清抑菌活性
[0096]
将活化后的乳酸菌按2％的接种量接种接入到无菌的mrs液体培养基中，于37℃厌氧条件下培养48h后，于4℃3,000r/min离心10min后取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。调整病原指示菌的活菌数约108cfu/ml，吸取200μl均匀涂抹在营养琼脂平板上，小心的放置无菌牛津杯在平板上，吸200μl乳酸菌发酵上清液于牛津杯中，在4℃冰箱扩散10h。小心的放置至37℃恒温培养箱，测量抗菌圈直径(diameter，d)。每个实验三次重复。
[0097]
表1乳酸菌q80和sr52-2发酵上清抑菌实验
[0098][0099]
注：符号+表示抗菌圈直径d《10mm；符号++表示10mm≤d≤15mm；符号+++表示15mm≤d≤20mm；符号++++表示d》20mm。
[0100]
益生菌产生抗微生物化合物的能力可能构成有效排除肠道中病原体存活和对宿主表达益生菌作用的关键特征。从表1中可以看出，乳酸菌q80和sr52-2对多种食源性致病菌都具有较强的抑菌活性，且抗菌圈直径均》20mm。
[0101]
实施例4乳酸菌的安全性评价
[0102]
(1)乳酸菌的抗生素敏感实验
[0103]
乳酸菌对抗生素是否敏感事评价细菌安全的一个重要指标。以金黄色葡萄球菌(s.aureus)25923为质控菌，分别选择10种常用抗生素：青霉素g(penicillin g，pen，10μg)、红霉素(erythromycin，ery，15μg)、大观霉素(spectinomycin，spe，100μg)、克拉霉素(clarithromycin，cla，15μg)、万古霉素(vancomycin，van，30μg)、克林霉素(clindamycin，clt，2μg)、四环素(tetracycline，tet，30μg)、米诺环素(minocycline，min，30μg)、环丙沙星(ciprofloxacin，cip，5μg)、和呋喃妥因(nitrofurantoin，nit，300μg)，参照临床和实验室标准化协会(clinical and laboratory standards institute，clsi)公布的药敏试纸标准，判断乳酸菌q80和sr52-2对抗生素敏感性实验。
[0104]
表2抗生素敏感实验
[0105]
[0106]
注：s：敏感；r：不敏感。
[0107]
由表2可以看出，q80和sr52-2对多种抗生素敏感，这说明本发明提供的乳酸菌安全性较高。
[0108]
(2)溶血实验
[0109]
乳酸菌在代谢过程中可能会产生溶血毒素溶解血红细胞，导致贫血等反应出现。在无菌条件下，将乳酸菌q80和sr52-2接种于绵羊血平板中，37℃培养48h，观察溶血现象。溶血现象会在血平板上形成三种特征：α溶血，菌落周围会出现草绿色溶血环，这种菌一般具有机会致病性；β溶血，菌落周围出现较宽的透明溶血环，一般来说致病性强；γ溶血，菌落周围无溶血环的出现，一般来说菌株无致病性。结果如图4所示，以s.aureus为阳性对照，q80和sr52-2菌落周围均无溶血环的出现，所以结果表明本发明提供的乳酸菌q80和sr52-2均为γ溶血，不具有溶血活性，无致病性。
[0110]
实施例5体内抗hbv的评价
[0111]
(1)实验动物分组、荷瘤体积、脏器指数的测定
[0112]
选择4周龄的雄性balb/c-nude裸鼠(来自于广东省医学实验动物中心)，均为spf(specific pathogen-free)级。将裸鼠置于受控环境条件下(温度23
±
3℃)，相对湿度60％
±
10％，光照/黑暗周期12/12h，实验过程中自由取水和食物。裸鼠适应性喂养1周后，随机分为5组：健康对照组(control group，con+ns)每天喂食0.1ml/只ns；模型对照组(model group，m+ns)每天喂食0.1ml/只ns；药物预防组(medicine group，m+lam)每天按21mg/(kg
·
只)的要求喂食同等体积的lam；乳酸菌q80预防组(m+q80)每天喂食109cfu/(0.1ml
·
只)的q80；乳酸菌sr52-2预防组(m+q80)每天喂食109cfu/(0.1ml
·
只)的sr52-2；乳酸菌q80辅助药物预防组(m+lam+q80)：每天喂食109cfu/(0.05ml
·
只)和同体积的lam(21mg/kg/只)；乳酸菌sr52-2辅助药物预防组(m+lam+sr52-2)：每天喂食109cfu/(0.05ml
·
只)和同体积的lam(21mg/kg/只)。除健康对照组外，其余4组实验的每只裸鼠皮下种植hepg2.2.15细胞1
×
106cells进行建模，从种植后的第二天开始每天对裸鼠进行灌胃。饲养期间每4d对裸鼠进行体重称量和肿瘤直径测量。本实验设计经广东省微生物研究所实验动物管理与伦理委员会批准，裸鼠按照标准指南进行维护。
[0113]
裸鼠建模成瘤的时间约44d(肿瘤直径》5mm为建模成功)，实验结束后，对裸鼠进行采用眼眶静脉取血并处死，立即切除心脏、肝脏、脾脏、肾脏、小肠和结肠，用预冷无菌pbs冲洗称重，冷冻于干冰中，-80℃保存直至分析。测定血清和肝脏组织中hbv dna和hbsag水平。
[0114]
表3各组裸鼠的脏器指数(n＝10)
[0115][0116]
注：与健康对照组相比的差异性，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001；与模型对照组相比的差异性，
#
表示p《0.05，
##
表示p《0.01，
###
表示p《0.001；i＝w/w0×
100％，式中，i表示脏器指数(％)，w表示裸鼠脏器的重量(g)，w0表示裸鼠体重(g)。
[0117]
脾脏作为荷瘤裸鼠体内最大的免疫器官，通过体液免疫发挥免疫作用，而脾脏系数可以在一定程度上体现荷瘤裸鼠免疫功能变化。有研究表明在无其他干扰条件下，脾脏系数越强，则荷瘤裸鼠的免疫功能越强。由表3和图5a-c可以看出，皮下荷瘤裸鼠的体重均显著性降低，与健康组(con+ns)相比，其他各组的肝脏指数均显著降低，且仅模型对照组(m+ns)的脾脏指数有显著性降低；与模型对照组(m+ns)相比，其他各预防组(m+lam、m+q80、m+sr52-2、m+lam+q80和m+lam+sr52-2)的肝脏指数均显著升；同时乳酸菌预防组(m+q80和m+sr52-2)和乳酸菌辅助预防组(m+lam+q80和m+lam+sr52-2)能够延缓肿瘤的发生，均具有统计学意义。由此，能够初步说明本发明提供的乳酸菌q80可以够缓解荷瘤裸鼠的体重减少和提高其免疫功能，同时还能延缓肝细胞癌的发生。
[0118]
(2)血清与肝脏中hbv dna、hbeag、hbsag的测定
[0119]
各组每只裸鼠分别取血清50μl和肝脏50.0mg经前处理后提取hbv dna，使用rt-qpcr对肝脏与血清中hbv dna含量进行测定，具体条件和操作同实施例2，并用酶联免疫法测定血清中hbsag、hbeag含量。实验结果如图5d-g所示，与模型对照组(m+ns)相比，各预防组(m+lam、m+q80、m+sr52-2、m+lam+q80和m+lam+sr52-2)的荷瘤裸鼠血清的hbv dna相对表达水平分别为21.70％
±
11.98％、28.81％
±
25.02％、9.00％
±
10.41％、20.63％
±
16.98％和17.06％
±
20.91％。模型对照组(m+ns)与各预防组(m+lam、m+q80、m+sr52-2、m+lam+q80和m+lam+sr52-2)荷瘤裸鼠血清中的hbsag含量分别为5.38
±
1.81iu/l、1.66
±
0.53iu/l、1.03
±
0.17iu/l、1.13
±
0.27iu/l、1.22
±
0.20iu/l和0.98
±
0.13iu/l；hbeag含量分别为43.91
±
11.52mg/l、22.38
±
5.38mg/l、26.03
±
6.43mg/l、12.93
±
8.17mg/l、31.09
±
4.48mg/l和10.44
±
4.53mg/l。这表明本发明提供的乳酸菌在体内具有对hbv也能发挥抗病毒作用，同时可以辅助抗病毒药物提高hbv dna、hbsag和hbeag转阴率。
[0120]
实施例6乳酸菌特异分子靶标验证
[0121]
(1)特异性新分子靶标的挖掘
[0122]
首先采用细菌基因组提取试剂盒(huankai biology，中国)提取纯化细菌的基因组dna，并对乳酸菌q80和sr52-2进行全基因测序，之后利用genbank数据库进行生物信息学
分析，分别筛选得到q80和sr52-2的特异性基因片段，q80和sr52-2所述基因片段的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
[0123]
seq id no.1：
[0124]
atgtcaagaaggagcagacgtcagagaggcaagctcttagaggctaaacgagagaagaaagaaaaagagatcaaagcgcaattgcagcaagaaatggaaagaagacgtcaagctaatctcaagccaaagccgcataaaattggaaaacgcaaaacggctctcctgtttgctgcagcgcacagcaaacatgatcgtcatcagccagacgttggtgtctcagtcactacccgtgttaggacaattcatttaagttcgagtccacatccaagctggcgcgagatggagaagattcagctgcatccagtgaatccccttgatttgcatgctgaagaagatgagggagttccagctagcctgacaggcatggcagtagattatttgactcgaatggcattaaccggtgaggatgctgcaaagacatttaacattgcttgtttgggctttcaaaattcaagatatatgtgtgaagatcagtattttgagactttttatcagctgctgaatgaagtcgatgaattacataaatccggaagcgcagactggattcgtttagctgcctatcctgcattggccttggtaacttgtgactcgctttatagagcgggcactggtaatccatttcatttgaaggatggtacagtagttccatggatcagtgatcgtacatgccttccggtaaccagtcataatattgatgagatggtacacagaggcattaaattgtttgaaaattatgagccactagtcgctgctaagattacgtttcaaggtggctatactggaataattgcttcaggcgacggagactacttgacagaaaatacactctgggacttcaaagtttcgattaaggaaccaaacaatcgccagcttctgcagctgctggtgtactggcagatgggcttgaaatcgattcacccagaatatcaaaaggtaaagtttcttgctttgttcaacccacgaactaatacgatataccgtctcagtacggatcaggtatctcctgaatgcgtgcgatggcttcagaatgatgtaattggttatggcaacggaatgcctcaattttag
[0125]
seq id no.2：
[0126]
atggcggacagttcgagaaccattatgactgatgcgggttttgcgttagaaacgcgggtccgcgctgatgaaacaaagatgcagtttacacgggccaccattagtacggacgaccactttagcgatacggacgacgctttagcaaagctaacggaattatctaatattcaacaagacgggaaggttacggcagtccaagtaattaacacgaccacggtttacgtacaagttgatgtgaatcaggccgagtcaaaggctgactatcagatgcggtccgcggccttatatgccaaggatgacgatggcacagaagtcttgtatggagtcaccgtgctacaggatcctgtctttgttcacaaagatgctgatggttcctatctgggttttggaattaataccactgtgggtagggcttctaacgtcgttgtagtggttgatcctgctaatatggtgactcagcaagtatttgagagtaccatgaaaaactactacacgaaggcggaagtcgacgccaaatttgtcaccgacgacgactttgccagcaagctgcccaagaacatcgcgacgaccgatgcggccaacaccttcgccaagtcgcagacgctcgcagggggcgccacggacggtgctggcaatgccatcgcgactaccaagaatgtctccgatggtgacgccgcgacactcacatcggcgaaggcatatgcggacacgaaggttagtggcaaagctgacgatagcaaagttgtgcatacagctgatatgcgcaaacctgcaaacgatgttgtaggactagaagatgttccacaagcacttgtaaaaacggctcttactgaccaaacagaccttgatacagttactacatctggaatctatccgttcgttaaaatacattttgtaaactatgtggacacagcagttcactggggatatttagaggttgttgttcaaggaaacattgttttccaaaccgcctatgatgatattgccggaacttgttatcaaagaaaatatataggttccccaacagtttggacaacctggtgcaagtatgctgatgatagcaaagtcgctcacctatctggagctaacaactttgacaccgttccaacggtcaataacaatccgttactactagcaagcagtttaccgtctgatttagcgcgaacaggacaagacgccaacttcactggtaaacttcagcagaatggtcaagatgtcgcacttgccaataatacgattgcccgcaaccctaacactggggttgtttctacacctactgacttcaccaagcttactgtgaacggaggtaaatcagtcgctaccgcggctgatttaaaaagcgttaaagatttggcttggcgtgaagtaactaactctgcgttccaaggaagctacctgtttagggacaatcaagatggaacagccagccttgccggaactatttatttttacagtcgatcccaacagtataatggaaatgacgactatattgtcccaatgccggatggttataaggcaactggagttgcttcagaagggtcattaatgggttttgtaaacgattttagcgtttcacttcaaggacttacggcttattttccaggaaccg
cgctgcatttatatactgaccttaatcaaaacagaccactatctattccattatgctcaataatcagttcttcaagcactgggattacaagtggtccaatgattctaaacgtcactaaaacaagttag
[0127]
(2)引物有效性检测
[0128]
根据(1)中的序列seq id no.1和seq id no.2设计特异性pcr扩增引物组(包括正向引物和反向引物)，引物组序列如下表4。
[0129]
表4特异序列pcr检测引物组
[0130][0131]
步骤s1 dna模板制备：将q80或sr52-2在无菌mrs液体培养基中增菌培养，使用细菌基因组dna提取试剂盒(huankai microbial，中国)提取其细菌基因组dna，作为待检模板；
[0132]
步骤s2 pcr扩增：q80和sr52-2的pcr扩增体系均为2
×
taq pcr mastermix(huankai microbial，中国)10μl，primer f 1.0μmol(终浓度)，primer r 1.0μmol(终浓度)，模板dna 1μl，rnase-free water补足体积至20μl。q80的pcr扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，64.0℃退火30s，72℃延伸30s，共执行30个循环；72℃延伸10min。sr52-2的pcr扩增体系同q80。sr52-2的pcr扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，68.1℃退火30s，72℃延伸30s，共执行30个循环；72℃延伸10min。
[0133]
步骤s3：取pcr扩增产物进行凝胶电泳，观察各组产物的扩增条带，若q80或sr52-2出现扩增单一条带相对应位置在其他组无扩增条带，则说明对应靶标是菌株特异性分子靶标。本发明针对q80选取20株德氏乳杆菌(包括5株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株)、128株其他非目标乳杆菌、124株非目标乳酸菌(包括56株乳球菌、52株魏斯氏菌和16株明串珠菌)和10株其他非乳酸菌共38个种284株不同的细菌对目标菌q80的特异性分子靶标进行验证。针对sr52-2选取58株短乳杆菌、116株其他非目标乳杆菌、42株非目标乳酸菌和10株其他非乳酸菌共34个种229株不同的细菌对目标菌sr52-2的特异性分子靶标进行验证。
[0134]
其中，步骤s1 dna模板制备为分别提取各细菌的基因组dna；步骤s2 pcr扩增时，使用的引物为引物组中的引物。设置空白对照，空白对照组的模板为不含基因组的rnase-free water。
[0135]
目标菌株q80和sr52-2特异性分子靶标的验证结果如下表5、表6、图6和图7所示，结果显示仅目标菌株出现单一的扩增条带，其他非目标菌株均不含有目的条带，这表明本方法中仅目标菌株含有该特异性分子靶标。
[0136]
表5目标菌q80特异性分子靶标评价试验结果
[0137]
[0138][0139]
表6目标菌sr52-2特异性分子靶标评价试验结果
[0140]
[0141][0142]
注：n表示空白对照，
“‑”
表示阴性，“+”表示出现目标条带。
[0143]
实施例7实时荧光定量pcr(real-time fluorescence quantitative pcr，rt-qpcr)检测乳酸菌q80或sr52-2的方法建立
[0144]
首先利用细菌基因组纯化试剂盒(huankai microbial，中国)分别纯化q80和sr52-2基因组dna，并以此基因组为模板和表4的特异性引物进行普通pcr。其次采用dna gel/pcr纯化试剂盒(huankai biology，中国)回收pcr产物，并检测其浓度。将浓度换算成拷贝数，dna浓度与拷贝数之间的换算公式如下：
[0145][0146]
式中，a表示每微升dna中的拷贝数(copies/μl)；
[0147]
c表示dna质量浓度(ng/μl)；
[0148]
l表示dna片段的长度(bp)。
[0149]
分别将q80和sr52-2的回收产物进行梯度稀释，使其拷贝数在102～10
10
之间。以梯度稀释后的产物为模板进行rt-qpcr。q80和sr52-2的rt-qpcr反应体系为：2
×
sybr qpcr supermix plus(huankai biology，中国)10μl，primer f(10μmol/l)0.5μl，primer r(10μmol/l)0.5μl，q80 dna 1μl，rox ii 0.4μl，rnase-free water补至20μl。q80的rt-qpcr反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性20s，64.0℃退火1min，共40次循环。sr52-2的rt-qpcr
反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性20s，68.1℃退火1min，共40次循环。以拷贝数和相应乳酸菌dna样品ct值制作标准曲线。同时观察引物扩增出产物的熔解峰是否为单一峰。结果如图8和图9所示，ct值与lg拷贝数成线性关系，图8a和图9a中的标准曲线为x表示lg拷贝数，y表示ct值。