一种可鉴别菠萝果实可溶性酸性转化酶基因AcoInv-1等位变异的分子标记和应用

本发明涉及农业生物技术，具体涉及一种可鉴别菠萝果实可溶性酸性转化酶基因acoinv-1等位变异的分子标记和应用。

背景技术：

1、菠萝是一种常见的热带果树，其果实富含糖分和营养成分，口感和风味独特，是一种深受大家喜爱的水果。虽然外界自然环境对果实中糖积累起到一定的调控的作用，但菠萝果实的糖分积累主要是受遗传因子的调控。研究发现不同采收季节的菠萝的物理化学特性有明显差异，冬季采收的果实可溶性固形物比其它季节收获的果实含量高。之前的研究结果发现，菠萝不同品种之间糖分含量差异明显，且主要受到遗传因素控制，不同菠萝品种果实糖分含量可相差1-2倍，且遗传稳定。菠萝属于多年生植物，且由于自交不亲和等问题，杂交十分困难。目前的育种技术，主要是通过配置杂交组合，在后代中筛选合适的材料。然而，这种方法不仅成本较大，而且周期较长，特别是对亲本的遗传背景了解不够，选育过程主要是靠人工的经验进行选择，缺乏科学的依据，导致后代材料筛选适合的品种难度较大。随着菠萝全基因组测序工作的完成，开发与含糖量密切相关的分子标记将成为可能，我们可以根据需要来筛选亲本材料，给选育合适糖分含量的菠萝新品种提供了新的方法和途径。

2、蔗糖转化酶(invertase，inv)在高等植物蔗糖代谢中起着关键的作用。研究表明，蔗糖转化酶参与植物的生长、器官建成、糖分运输、韧皮部卸载及调节库组织糖分构成及水平，inv可以不可逆的催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，是蔗糖分解中的重要调控酶。根据不同的分类方法，可将其分为不同的家族，根据其水溶性可分为可溶性和不可溶性inv，根据其最适ph不同又可分成酸性inv和中性/碱性inv两类，它们的主要功能都是降解蔗糖，只是存在的部位不同；可溶性酸性inv，是主要存在于液泡中，催化蔗糖水解成己糖，起着调节植物组织中糖的积累和液泡中蔗糖利用的作用，其结构与中性转化酶存在很大的不同，但是有关其蛋白结构和特性的研究还比较少。inv在成熟库器官液泡的蔗糖积累中起关键作用。液泡中inv的活性对蔗糖的含量有很大的影响。目前已经成功的从番茄、拟南芥、胡萝卜、马铃薯、甘蔗、水稻、甜高粱等作物中克隆出了inv基因dna序列或cdna序列，并成功开发了番茄、甜高粱的分子标记，但未见有关菠萝inv基因克隆和分子标记的有关报道。

3、因此，开发可鉴别菠萝果实可溶性酸性转化酶基因等位变异的分子标记显得十分必要。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，而提供一种可鉴别菠萝果实可溶性酸性转化酶基因acoinv-1等位变异的分子标记，该分子标记选自inv基因的等位变异，有助于育种工作者从众多菠萝品种中寻找优良的亲本材料，不用通过繁复的栽培试验及测定来进行鉴别。

2、本发明的目的之二在于提供上述可鉴别菠萝果实可溶性酸性转化酶基因acoinv-1等位变异的分子标记在辅助选择高含糖量潜力的菠萝品种中的应用。

3、本发明的目的通过以下技术方案实现：

4、提供一种可鉴别菠萝果实可溶性酸性转化酶基因acoinv-1等位变异的分子标记，所述分子标记采用如下引物扩增而来：

5、正向引物：5-ctgcgaaatgaactagtcaactc-3，

6、反向引物：5-tagagaaccgttcttggaatgg-3。

7、上述技术方案中，所述分子标记具有如seq id no.1所示的144bp的核苷酸序列。

8、上述技术方案中，所述分子标记具有如seq id no.2所示的125bp的核苷酸序列。

9、具体制备方法如下：

10、(1)以公布的菠萝全基因组序列为基础(pineapple.angiosperms.org)，找出与可溶性酸性转化酶相似的基因(aco016281.1，acoinv-1)，通过比较不同品种材料的等位变异差异，选取上下游具有共同的核苷酸序列的区段进行引物设计，共设计3段引物，引物设计保证每段序列之间都含有150bp左右的重叠序列。

11、(2)以菠萝品种“巴里”的全dna为模板，对这3段序列进行克隆。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，每对引物所得pcr产物均出现单一条带，获得的片段分别约为2300bp、2500bp和1700bp左右，与推测的大小基本一致。将3条pcr产物回收后克隆测序，得到3条带有150bp左右的dna重叠的序列，将这3条序列进行拼接，得到一个菠萝inv基因组dna片段，命名为acoinv-1。

12、本发明利用dnaman、dnastar等软件对获得的3段序列进行拼接获得菠萝acoinv-1，其生物信息学分析如下：

13、该基因全长6290bp，如seq id no.3所示，acoinv-1通过与菠萝基因组网站(pineapple.angiosperms.org)序列进行比对，确定acoinv-1所在的位置和拷贝数，结果显示acoinv-1基因在菠萝基因组第3条染色体上，且只有一个拷贝；acoinv-1在编码区内，包含始密码子和终止密码子，存在6个外显子和5个内含子，以及1个38bp的5’非翻译区和1个58bp的3’非翻译区。acoinv-1序列与已经报道的其他作物inv基因相似性较高，据此推测本发明获得的acoinv-1为菠萝的可溶性酸性转换酶基因的全长序列。

14、菠萝acoinv-1基因cdna序列，该序列全长为2046bp，如seq id no.4所示，与水稻、甘蔗、玉米inv基因序列相似性很高。菠萝acoinv-1基因cdna序列编码1个含有681个氨基酸的多肽，如seq id no.5所示；对此蛋白进行保守结构域分析，结果表明此蛋白含有一个完整的糖基水解酶(glycosyl hydrolases family 32)结构域，此结构域具有水解蔗糖的功能。

15、本发明还提供上述可鉴别菠萝果实可溶性酸性转化酶基因acoinv-1等位变异的分子标记在辅助选择高含糖量潜力的菠萝品种中的应用。

16、具体方法如下：

17、本发明选择总糖含量差异较大的16份菠萝材料作为标记筛选的供试材料，利用设计的引物(见表1)扩增这16份材料出苗两周后幼嫩的叶片的dna，扩增结果进行测序，拼接后分别得到16份材料的acoinv-1基因全长序列。利用dnaman软件中的多重序列比对程序进行序列比，利用dna sp4.9软件进行dna多态性分析和单体型分析，16份材料分为2种单倍型，分别为acoinv-1a和acoinv-1b。这两种类型的最大区别为acoinv-1b的在第二内含子区段存在一个19bp的缺失片段。

18、本发明根据acoinv-1a和acoinv-1b的等位变异序列差异开发了一个共显性的分子标记acoinv-1x(正向引物：5-ctgcgaaatgaactagtcaactc-3；反向引物：5-tagagaaccgttcttggaatgg-3)。此对引物扩增以上16份材料的dna，扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果表现出了扩增产物的多态性。本发明依据菠萝inv基因等位变异类型将16份材料分成了2种类型。16份菠萝材料中，有12份材料为acoinv-1a类型，既在的材料中可以扩增出144bp的片段；有4份材料为acoinv-1a和acoinv-1b的杂合型材料，可以同时扩增出125bp和144bp两个条带。上述结果证明该分子标记可用于鉴别不同菠萝材料的inv基因的等位变异类型。

19、进一步的，本发明利用该acoinv-1x标记检测164份菠萝材料：(1)有153份材料能扩增出144bp的条带(acoinv-1a)，有11个材料能扩增出125bp和144bp两个条带(acoinv-1a和acoinv-1b)；(2)在acoinv-1a中，绝大多数材料总糖含量都集中在14～18％之间，占到总数的82％；而在acoinv-1a和acoinv-1b材料中，绝大多数总糖含量都集中在8～14％之间，占到总数的86％；对164份材料的总糖含量与分类综合分析结果，越趋于高含糖量区域，特别是总糖含量高于14mg/g后，acoinv-1a型较acoinv-1a和acoinv-1b型明显占的比例要多。(3)本发明对两种类型的菠萝材料果实总糖含量平均值进行统计分析，acoinv-1a类型的材料总糖含量的平均值为14.91，而含有acoinv-1a和acoinv-1b类型的材料总糖含量的平均值为11.29，acoinv-1a类型的材料总糖含量的平均值极显著高于acoinv-1a和acoinv-1b类型的材料。上述结果表明，该标记的扩增片段与菠萝果实总糖含量呈极显著相关。