一株合成聚羟基脂肪酸酯的蜡样芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物，涉及一株新型革兰氏阳性细菌及其应用，具体涉及一株蜡样芽孢杆菌，及其在生物合成聚羟基脂肪酸酯(pha)中的应用。

背景技术：

1、以化石原料合成传统聚合物(塑料)被广泛应用到包装、建筑、电子、生物医学、环境等领域，带给人类生活许多便利，与人类生活不可分割。正由于合成聚合物塑料的广泛适用性，人类对以石油为基础原料的传统合成化工产品过度依赖。大量生产合成聚合物，伴随而来的问题之一是石油能源枯竭。统计数据显示，2020年全球塑料产量约3.68亿吨，预计到2050年塑料产量将达到5.89亿吨(plastics-the facts 2021an analysis of europeanplastics production,demand and waste data.plastics europe,2021；globalplastics industry-statistics&facts.statista,2021)。传统合成聚合物的难降解性也引起了一系列环境污染问题。从日常生活中一次性塑料、过度包装和乱扔垃圾等问题，延伸到所产生的二次污染(微塑料、有毒副产物)均有迹可循。所产生的污染物由于其难降解性，逐渐在水体和土壤中累积，导致生物多样性减少等问题产生。

2、近年来，不同类型的可生物降解塑料材料被开发出来。可生物降解塑料能在不破坏环境的前提下，满足当今社会对塑料的需求。其中聚羟基脂肪酸酯(pha)是可生物降解塑料的研究热点，被认为是最具发展前景类型之一。因为它具有生物相容性、生物可降解性等特殊性质。此外，它具有不溶于水、无毒、环境兼容性、压电性、弹性和热塑性等多方面的优良特性。pha是细胞内合成的聚酯颗粒，是细菌在营养失衡的情况下用于储存碳源和能源的物质形式，进而保护其免受环境压力迫害。通常，生物合成pha需要特定的菌株和发酵工艺，再根据产物的聚合性质，从菌株代谢产物中提取和分离具有较高纯度的pha。

3、在此前的研究中，采用生物合成法工业化生产pha多数应用如钩虫贪铜菌和重组大肠杆菌等革兰氏阴性菌。然而，使用这些细菌生物合成pha需严格控制培养基中碳氮比。所提供的碳源在化学结构上也需与pha单体相关或相似，以便高效合成。而且，其合成机制需遵循次级代谢途径，以延长发酵可持续的时间。目前关于pha合成的革兰氏阴性菌的专利有：欧洲专利wo2014/053687-al(et al.,2014)、美国专利us 8334129(et al.,2014)、us 2010/0267016(et al.,2014)，日本专利jp2005295993(gyu et al.,2005)和中国专利cn106574279a(fukui&orita,2017)。然而，从经济角度上考虑，利用革兰氏阴性菌株大批量生产pha可行性较低。研究表明，利用此类菌株合成pha在下游加工工艺纯化过程中容易受到脂聚糖免疫原污染。脂聚糖是革兰氏阴性菌的细胞膜组成成分，能引起人类免疫反应，因此需要利用后续工艺再处理，从而增加下游工艺成本，如美国专利us 8771720b2(williams et al.,2012)、us6623748 b2(clokie，2002)、us 9290612 b2(martin et al.,2014)所述。另外，目前仅有少数利用革兰氏阳性菌生产pha的报导，但产量相对较低，如中国专利cn108865950a(yang etal.,2018)、美国专利us 2018/0066291(berekaa et al.,2019)。根据此前报道，蜡样芽孢杆菌采用简单碳水化合物发酵时，存在碳源利用效率低下的问题(mohandas etal.biosynthesis and characterization of polyhydroxyalkanoate from marinebacillus cereus mccb 281utilizing glycerol as carbon source.int j biolmacromol.119:380-392.doi:10.1016/j.ijbiomac.2018.07.044.2018；labuzek etal.biosynthesis of phb tercopolymer by bacillus cereus uw85.j applmicrobiol.90(3):353-7.doi:10.1046/j.1365-2672.2001.01253.x.2001)。

4、由于以上菌株本身的限制性，增加了pha生物合成的生产成本，使得与传统石化基础聚合物合成相比，生物合成成本高3-4倍，进而限制了其在环境和生物医学等领域的应用发展。这些限制性因素也使得生物合成pha在可持续发展和循环经济体系中的贡献不突出。菌株的低产量且对碳源的需求(＞45％生产成本)和聚合物回收工艺(＞26％生产成本)是造成高成本主要原因。因此，需要通过筛选底物利用率高、pha细胞积累量高和能够简化回收纯化产物工艺的菌株来解决这些问题。

技术实现思路

1、本发明目的之一是提供一株新型革兰氏阳性细菌,是一种具有高效合成聚羟基脂肪酸酯(phas)能力的蜡样芽孢杆菌。

2、本发明的另一目的是提供所述的蜡样芽孢杆菌在合成聚羟基脂肪酸酯中的应用。

3、本发明的革兰氏阳性细菌,该菌株经鉴定为蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)，菌株名为iba1，于2021年9月2日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc),保藏编号为cgmcc no.23343。保藏单位地址为：中国，北京，中国科学院微生物研究所,邮编100101。

4、本发明所述的菌株是从香港浸会大学生物资源与农业研究所提供的厨余水解液中分离得到。

5、本发明所述的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)iba1在营养琼脂培养基(nutrient agar)上生长良好。菌落形态呈圆形，表面粗糙，乳白色，边缘呈波状。显微镜下该细菌呈杆状，呈革兰氏阳性，且能产孢子。

6、所述的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)iba1是通过以下分离筛选方法得到的:厨余水解液样本由香港浸会大学生物资源与农业研究所提供。取1ml水解液加入9ml无菌蒸馏水中，然后进行连续稀释。将连续稀释的水解液分别涂布在营养琼脂平板上，在37℃培养箱中培养24-48小时。在营养琼脂培养基上获得的单菌落，通过二次筛选后得到菌落为本发明所述的菌株。将分离的单菌落接种于营养培养液进行纯培养和保存。进行16s rrna pcr扩增并测序。将所得的序列与ncbi数据库进行比对，结果显示该菌株16s rrna序列与蜡样芽孢杆菌bacillus cereus相似性为100％，命名为iba1。

7、本发明还提供了所述的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)iba1在生物合成聚羟基脂肪酸酯中的应用。

8、进一步地，应用所述蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)iba1合成聚羟基脂肪酸酯的方法是，将所述蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)iba1接种于含碳源的发酵培养基中，发酵培养，所述蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)iba1菌体内累积聚羟基脂肪酸酯。

9、进一步地，所述蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)iba1可以利用简单碳源生物发酵，包括但不限于碳水化合物和醇类，如葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油中的一种或几种。优选地，利用葡萄糖作为蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)iba1发酵的简单碳源。

10、优选地，发酵培养基配方为:碳源20-80g/l、酵母膏2.5-7.5g/l、蛋白胨2.5-7.5g/l、氯化钾0.5-5g/l、硫酸铵0.5-5g/l，初始ph为4-7。

11、进一步地，所述蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)iba1的接种量优选为2-10％(v/v)。

12、进一步地，发酵条件优选为：发酵温度为20-40℃，转速为150-200rpm，发酵培养时间为48-120小时。

13、优选地，所述的聚羟基脂肪酸酯为聚羟基丁酸酯(phb)。

14、进一步地，菌体内累积的聚羟基脂肪酸酯采用甲醇氯仿法提取。

15、有益效果：根据本发明所述的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)iba1为一种新型革兰氏阳性细菌,且具有高效合成phas能力。采用高效的革兰氏阳性菌取代传统革兰氏阴性菌生产聚羟基脂肪酸酯(pha)，能解决高成本生产的问题。利用革兰氏阳性菌蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)iba1生物合成pha的突出优点包括：可利用简单碳源，如葡萄糖等进行生物合成聚羟基脂肪酸酯，特别是聚羟基丁酸酯(phb)，碳源利用率可高达95％。在发酵过程中，生物量呈指数增长，可达到22.0g/l以上，所积累的pha颗粒达到细胞容量的78.5％左右，其回收率可高达17.5g/l左右。该菌株所合成的产物避免了脂聚糖免疫原的物质污染，减少下游纯化工艺成本，可进一步扩大其适用性，能够更加安全地应用于环境和生物医学等各种领域中。