用于预测金黄色葡萄球菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法与流程

1.本发明涉及基因测序技术，具体说，是一种用于预测金黄色葡萄球菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌是医院和社区感染的主要病原体之一，在我国临床分离率高居第三位(2021年chinet数据)，可引发多种传染病，例如皮肤和软组织感染，心内膜炎，骨髓炎，菌血症和致命性肺炎。根据对抗生素的敏感性，金黄色葡萄球菌可分为对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(mssa)和对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(mrsa)。近几十年来，由于细菌的进化和抗生素的滥用，金黄色葡萄球菌的耐药性在世界范围内，mrsa的感染已逐渐增加，mrsa的感染率也在增加，并且针对mrsa的临床抗感染治疗变得更加困难。越来越多的证据表明，金黄色葡萄球菌的耐药机制非常复杂，尤其是对于对多种抗生素具有耐药性的mrsa。因此，建立准确、快速的检测方法对金黄色葡萄球菌进行药敏表型进行预测，对指导临床治疗十分重要。
3.mrsa耐药性是由编码青霉素结合蛋白2a或2'(pbp2a或pbp2')(meca)的基因产生的。此外，mrsa已迅速成为在世界许多地方(包括欧洲，美国，北非，中东和东亚)发现的最常见的抗药性病原体。在中国，医院获得性mrsa的比例已达到50.4％。金黄色葡萄球菌的内源性耐药机制主要包括三个方面。(1)外膜通透性。当细胞膜通透性降低时，细菌的能量代谢受到影响，因此药物吸收减少，导致耐药性。例如，金黄色葡萄球菌对氨基糖苷类的耐药性是由膜通透性的降低引起的，最终导致药物摄入的减少。(2)外排系统。金黄色葡萄球菌细胞膜上存在三种类型的多药泵蛋白：qaca，nora和smr。(3)β-内酰胺酶生产过多。mrsa过度分泌β-内酰胺酶主要通过水解机制和夹捏机制降低了抗生素的作用，这导致了mrsa耐药。
4.目前针对金黄色葡萄球菌的耐药性检测可分为表型检测和基因型检测方法。在表型检测方面，临床的主要方法是微生物培养+药敏实验，该方法存在培养时间长，培养阳性率低等局限性，而无法完全满足临床精准治疗的需求。在基因检测方面，主要是针对特定、有限的耐药基因进行检测，该检测内容较单一，并不能反应真实的药敏结果。因此亟需寻找一种快速，不依赖于培养，且准确性高的检测临床常用抗生素药敏表型的方法以指导临床精准治疗。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于预测金黄色葡萄球菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法，可一次性分析头孢西丁、克林霉素、红霉素、甲氧西林、苯唑西林、环丙沙星和青霉素7种抗生素耐药情况，具有较好的准确率、敏感度和特异性。
6.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于预测金黄色葡萄球
菌对抗生素药敏表型的特征基因组合，抗生素为头孢西丁、克林霉素、红霉素、甲氧西林、苯唑西林和青霉素中的一种或几种组合，
7.预测金黄色葡萄球菌对头孢西丁药敏表型的特征基因组合包括meca、meci，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
8.预测金黄色葡萄球菌对克林霉素药敏表型的特征基因组合包括erma、ermc、ermb，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
9.预测金黄色葡萄球菌对红霉素药敏表型的特征基因组合包括erma、ermc、msra、ermb、ermt，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
10.预测金黄色葡萄球菌对甲氧西林药敏表型的特征基因是meca，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若检测结果为阳性，推测为耐药；
11.预测金黄色葡萄球菌对苯唑西林药敏表型的特征基因是meca，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若检测结果为阳性，推测为耐药；
12.预测金黄色葡萄球菌对环丙沙星药敏表型的特征基因突变位点组合是sta_parc:239(c-》t)、sta_parc:239(c-》a)、sta_gyra:251(c-》t)、sta_gyra:250(t-》g)，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
13.预测金黄色葡萄球菌对青霉素药敏表型的特征基因是blaz、meca，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若检测结果为阳性，推测为耐药。
14.含有上述用于预测金黄色葡萄球菌对抗生素药敏表型的特征基因组合检测试剂的试剂盒。
15.采用上述试剂盒对金黄色葡萄球菌进行药敏表型预测的测序方法，采用全基因组测序方法或宏基因组测序方法。
16.本发明的有益效果是：本发明是基于核酸分子检测耐药的方法，可不依赖于细菌培养，直接针对临床标本或其他方式取得的少量金黄色葡萄球菌基因组核酸进行检测，并根据本发明提供的特征基因组合预测其药敏表型，相比传统方法具有检测周期短，检测灵敏度高的特点。
附图说明
17.图1是用于头孢西丁药敏表型预测的特征基因在公共数据库下载的金黄色葡萄球菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
18.图2是用于克林霉素药敏表型预测的特征基因在公共数据库下载的金黄色葡萄球菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
19.图3是用于红霉素药敏表型预测的特征基因在公共数据库下载的金黄色葡萄球菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
20.图4是用于甲氧西林药敏表型预测的特征基因突变位点在公共数据库下载的金黄色葡萄球菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
21.图5是用于苯唑西林药敏表型预测的特征基因突变位点在公共数据库下载的金黄色葡萄球菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
22.图6是用于环丙沙星药敏表型预测的特征基因突变位点在公共数据库下载的金黄色葡萄球菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
23.图7是用于青霉素药敏表型预测的特征基因突变位点在公共数据库下载的金黄色葡萄球菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.本发明的一种用于预测金黄色葡萄球菌对抗生素药敏表型的特征基因组合，抗生素为头孢西丁、克林霉素、红霉素、甲氧西林、苯唑西林、环丙沙星和青霉素中的一种或几种组合，
26.预测金黄色葡萄球菌对头孢西丁药敏表型的特征基因组合包括meca、meci，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
27.预测金黄色葡萄球菌对克林霉素药敏表型的特征基因组合包括erma、ermc、ermb，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
28.预测金黄色葡萄球菌对红霉素药敏表型的特征基因组合包括erma、ermc、msra、ermb、ermt，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
29.预测金黄色葡萄球菌对甲氧西林药敏表型的特征基因是meca，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若检测结果为阳性，推测为耐药；
30.预测金黄色葡萄球菌对苯唑西林药敏表型的特征基因是meca，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若检测结果为阳性，推测为耐药；
31.预测金黄色葡萄球菌对环丙沙星药敏表型的特征基因突变位点组合是sta_parc:239(c-》t)、sta_parc:239(c-》a)、sta_gyra:251(c-》t)、sta_gyra:250(t-》g)，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
32.预测金黄色葡萄球菌对青霉素药敏表型的特征基因是blaz、meca，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若检测结果为阳性，推测为耐药。
33.含有上述用于预测金黄色葡萄球菌对抗生素药敏表型的特征基因组合检测试剂的试剂盒。
34.采用上述试剂盒对金黄色葡萄球菌进行药敏表型的测序方法，采用全基因组测序方法或宏基因组测序方法。
35.下面结合具体的检测方法和效果对比，对本发明进行详细说明：
36.实施例1用特征组合对公共数据库中金黄色葡萄球菌的药敏表型进行预测
37.1.1数据收集：从公共数据库(ncbi ndaro数据库和patric数据库)下载2946株金黄色葡萄球菌基因组信息及其对应抗生素药敏表型数据。其中头孢西丁(英文缩写cefoxitin)耐药株702株，敏感株201株；克林霉素(英文缩写clindamycin)耐药株333株，敏感株555株；红霉素(英文缩写erythromycin)耐药株726株，敏感株1283株；甲氧西林(英文缩写methicillin)耐药株949株，敏感株694株；苯唑西林(英文缩写oxacillin)耐药株75株，敏感株368株；环丙沙星(英文缩写ciprofloxacin)耐药株764株，敏感株958株；青霉素(英文缩写penicillin)耐药株900株，敏感株138株。
38.1.2耐药基因及突变检测：用ncbi-blast(v2.9.0+)软件将组装好的基因组序列与耐药数据库进行比对(参数：-evalue 1e-5-outfmt 0-num_alignments 10000)，进行上述耐药基因和突变位点检测。对于基因有无特征，与该耐药基因的参考序列的比对一致率高于90％且覆盖率高于60％，则认为有该耐药基因检出。对于基因突变特征，若比对上该耐药基因的序列支持该突变位点，则认为有该突变检出。
39.1.3统计各金黄色葡萄球菌的菌株中耐药基因和突变的检出情况。
40.1.4药敏结果预测：对于某一株菌的任一种抗生素的药敏预测，检测出特征组合中的任一种特征，则认为该菌株对该抗生素表型耐药；否则，则判断为敏感。如图1-图7所示，头孢西丁、克林霉素、红霉素、甲氧西林、苯唑西林、环丙沙星和青霉素七种模型中，通过各菌株中的检出的特征预测得到的药敏结果，和实际药敏表型高度一致。预测性能如表1所示，特征组合预测头孢西丁、克林霉素、红霉素、甲氧西林、苯唑西林、环丙沙星和青霉素的药敏表型准确率分别为0.999、0.976、0.985、0.990、0.977、0.990、0.982，特异性和敏感度也在较高的水平。各耐药特征的特征检出样本数、表型耐药样本数和阳性预测值(阳性预测值＝表型耐药样本数/特征检出样本数)见表2。上述结果说明，利用上述特征组合，对金黄色葡萄球菌表型耐药和表型敏感有较好的区分效果。
41.表1.预测公共数据库来源菌株的药敏表型的性能
[0042][0043]
表2.特征基因和突变在公共数据库来源的菌株中的检出频数
[0044][0045]
[0046]
实施例2用特征组合对临床标本中分离的金黄色葡萄球菌的药敏表型进行预测
[0047]
2.1样本采集：从某医院采集从临床标本中分离的金黄色葡萄球菌459例，并收集相应的药敏结果。其中，头孢西丁耐药39株，敏感38株；克林霉素耐药51株，敏感25株；红霉素耐药53株，敏感23株；苯唑西林耐药38株，敏感38株；环丙沙星耐药15株，敏感62株；青霉素耐药75株，敏感2株。
[0048]
2.2样本全基因组测序：对样本进行核酸提取，qubit检测后，确认dna可以满足后续测序要求，对提取的核酸进行测序文库建库及高通量测序(illumina novaseq 6000 pe150)。
[0049]
2.3测序数据质量控制：使用fastp(v0.19.5)软件对得到的原始fastq序列数据进行过滤(参数设置：-q 15
ꢀ‑
u 40
ꢀ‑
l read_length*0.67),去除低质量和短序列；同时使用komplexity(v0.3.6)软件计算序列信息复杂度(参数设置：-f
ꢀ‑
t 0.4)，并过滤掉低复杂度的序列。
[0050]
2.4耐药基因检测：使用blastn(版本2.9.0+)软件将reads序列与耐药基因参考序列进行比对。对于基因有无特征，参考序列的比对一致率高于90％的reads大于1条，则认为有该耐药基因检出。对于基因突变特征，针对某一突变位点，如果支持该突变位点的reads比例大于0.2，则认为有该突变检出。
[0051]
2.5药敏表型预测：对于某一株菌的任一种抗生素的药敏预测，检测出特征组合中的任一种特征，则认为该菌株对该抗生素表型耐药；否则，则判断为敏感。根据特征检出结果，与医院检验科得到的药敏结果相比，准确率、敏感度和特异性均在0.9以上。检出结果总结于表3。以上结果说明，对实际收集的从临床标本中分离的金黄色葡萄球菌，利用相应特征组合也有着较高的准确率、敏感度和特异性，说明本发明有较高的实用价值。
[0052]
表3.预测医院收集菌株的药敏表型的性能
[0053]
[0054]
实施例3用特征组合对临床标本中的金黄色葡萄球菌进行药敏表型预测
[0055]
3.1样本采集：从某医院采集了培养结果为金黄色葡萄球菌阳性，且进行了药敏测试的临床标本22例，包括痰液、肺泡灌洗液、腹水、引流液、穿刺液、分泌物、脓液。
[0056]
3.2样本高通量测序测序：对样本进行dna提取、通过qubit检测，确认dna质量可以满足后续测序要求，对提取的dna进行文库建库及高通量测序(illumina nextseq 550 se75)。
[0057]
3.3测序数据指控：使用fastp(v0.19.5)软件对得到的原始fastq序列数据进行过滤(参数设置：-q 15
ꢀ‑
u 40
ꢀ‑
l read_length*0.67),去除低质量序列和过短序列；同时使用komplexity(v0.3.6)软件计算序列信息复杂度(参数设置：-f
ꢀ‑
t 0.4)，并过滤掉低复杂度的序列。
[0058]
3.4人源序列去除：将质控过滤得到的clean序列，使用bowtie2(v2.3.4.3)软件进行与人参考基因组序列(human_38)进行比对(参数设置：
‑‑
mm
ꢀ‑‑
very-sensitive
ꢀ‑
k 1)，以过滤掉人源序列。
[0059]
3.5物种注释：使用minimap2软件(v2.17)将illumina reads序列与以上设定的目标病原参考基因组序列库(来源于ncbi genome数据库)进行比对(比对参数：-x sr-a
‑‑
secondary＝no-l))，并采用lca算法进行物种注释统计，最后统计检出金黄色葡萄球菌的序列数和基因组覆盖度。
[0060]
3.6耐药特征检测：使用blastn(版本2.9.0+)软件将reads序列与耐药基因参考序列进行比对。对于基因有无特征，参考序列的比对一致率高于90％的reads大于1条，则认为有该耐药基因检出。对于耐药基因突变特征，针对某一突变位点，如果支持该突变位点的reads比例大于0.2，则认为有该突变检出。
[0061]
3.7药敏表型预测：用2.1所述的各抗生素的特征组合对临床标本中金黄色葡萄球菌对各抗生素的药敏表型进行预测。针对某一个抗生素，有任一重要特征检出，则认为金黄色葡萄球菌对该抗生素耐药；否则，金黄色葡萄球菌对该药敏感。当检出的基因组覆盖度小于一定比例且没有耐药特征检出时，由于不能确定该特征是否存在(特征可能存在于未覆盖的区域)，因此无法给出预测。表4为部分临床标本统计结果：
[0062]
表4.部分临床标本的检测信息
[0063]
[0064]
[0065]
[0066]
[0067]
[0068]
[0069]
[0070][0071]“/”表示在当前基因组覆盖度下，无法对药敏表型进行预测。
[0072]
基因组覆盖度表示在宏基因组测序得到的数据中，归属于金黄色葡萄球菌的reads比对上的参考基因组的碱基数和参考基因组全碱基数的比率。由表5可见，通过宏基因组测序方法，利用上述优选的特征组合，可预测绝大部分临床标本中的金黄色葡萄球菌对七种抗生素的药敏表型，且准确率高，说明本发明在辅助金黄色葡萄球菌感染的治疗中有较高的应用价值。
[0073]
表5.利用优选特征组合预测临床标本中的金黄色葡萄球菌的药敏表型的性能
[0074][0075]
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。